赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）表观遗传调控结直肠癌肝转移中肿瘤相关巨噬细胞可塑性及免疫检查点PD-L1表达

《Molecular Biomedicine》：Lysine-specific demethylase 1 (LSD1) regulates macrophage plasticity and immune checkpoint expression in colorectal liver metastases

结直肠癌肝转移（colorectal liver metastases, CRLM）是结直肠癌死亡的主要原因，其特征为深度免疫抑制的肿瘤微环境，其中肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages, TAMs）发挥核心作用。然而，驱动TAM可塑性和维持的分子机制仍知之甚少。本研究调查了CRLM中的巨噬细胞异质性，并考察表观遗传调控因子赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1, LSD1）对TAM极化的贡献。通过流式细胞术、免疫组织化学和转录谱分析患者来源标本，鉴定出一群富集于瘤周微环境的大TAMs（large TAMs, L-TAMs），其呈现免疫抑制性M2样表型，并与不良临床结局相关。相反，较小的TAMs（small TAMs, S-TAMs）表现出更炎症性的转录程序，包括IL1β表达增加。肿瘤条件培养基（tumour-conditioned media, TCM）在体外重现了这些不同的巨噬细胞表型，表明肿瘤来源因子主动塑造TAM身份。使用黄芩苷（baicalin）或INCB059872药理学抑制LSD1可降低CD206和免疫检查点分子程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）的表达，与巨噬细胞从促肿瘤状态重编程一致。总之，这些发现确定LSD1为CRLM中巨噬细胞可塑性的表观遗传调控因子，参与免疫抑制性TAM表型的维持，并可能诱导表型逆转。研究人员的发现确定LSD1为TAM表型的调控因子，并支持进一步研究靶向LSD1作为重塑转移性肿瘤微环境并可能增强抗肿瘤免疫的策略。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症死亡的重要负担，肝脏是最常见的远处转移器官，结直肠癌肝转移（colorectal liver metastases, CRLM）预后差且治疗选择有限。转移性CRC的肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）高度免疫抑制，限制系统治疗尤其是免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）的疗效。TAMs是肿瘤生长、血管生成和免疫抑制的关键调控者，具有显著可塑性，可在M1样抗肿瘤与M2样促肿瘤状态间转化。CRLM中瘤周TAM形态与预后相关，大TAMs（large TAMs, L-TAMs）与不良临床结局相关，且形态学可在常规病理标本中评估，是研究巨噬细胞异质性的可用替代指标。表观遗传调控可在不改变DNA序列的情况下影响基因功能，是重教育TAMs向促炎、抗肿瘤表型转化的重要方向。LSD1（KDM1A）是髓系细胞分化和功能的表观遗传调控因子，通过修饰组蛋白标志控制基因表达，并在CRLM免疫抑制性TAM亚群尤其L-TAMs中高表达；但LSD1是否参与维持转移性微环境中免疫抑制表型和免疫检查点调控尚不清楚。研究人员将患者来源TAM表型分析与体外功能模型结合，发现L-TAM富集与不良临床结局相关，LSD1药理抑制可减弱免疫抑制性巨噬细胞特征，包括CD206和PD-L1表达；据此认为LSD1是TAM可塑性的调控因子，为表观遗传调控重塑转移性免疫微环境提供依据。该论文发表于《Molecular Biomedicine》。

技术方法概括（不超过250字）：研究人员使用2020—2024年意大利IRCCS Humanitas Research Hospital手术切除的CRLM患者样本，取距肿瘤>2 cm的健康肝组织和<1 cm的瘤周组织；采用流式细胞术、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）、免疫荧光（immunofluorescence, IF）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、RT-qPCR、bulk RNA-seq及基因集富集分析（GSEA；GEO GSE131353，n=5对配对S/L-TAM）、患者来源原代CRLM细胞培养及条件培养基、细胞因子Bio-Plex谱分析（n=24）、LSD1抑制剂（baicalin、INCB059872）处理、细胞活力与形态分析，并在独立队列（n=4）中用RT-qPCR验证。

研究结果：
Characterisation of macrophage phenotypes in healthy and peritumoral tissue from patients with CRLM：研究人员对14例CRLM患者健康肝与瘤周肝组织行流式分析，鉴定7个单核/巨噬细胞簇；簇1为CD68-hi、CD163/CD206/HLA-DR及前向散射信号高且均一的L-TAM样细胞，簇2—4为CD68-dim且体积较小、按CD163和HLA-DR表达进一步区分；瘤周组织中簇1（CD68^hi_CD163⁺⁺⁺⁺）和簇2（CD68^dim_CD163⁺⁺⁺）占总巨噬细胞比例升高，CD163染色显示瘤周巨噬细胞浸润更高；IHC和TEM证实瘤周存在形态不同的S-TAMs与L-TAMs，L-TAMs更大、形状不规则且细胞内复杂；33例患者生存分析显示L-TAM丰富者中位无复发生存期（recurrence-free survival, RFS）较短（5.4个月 vs. 8.8个月，p=0.045），且基线疾病负担和化疗反应无差异。
Transcriptional profiling reveals distinct functional programmes in S-TAMs and L-TAMs from human CRLM：研究人员再分析5例配对分选S-TAM与L-TAM的bulk RNA-seq数据，主成分分析显示二者转录谱明显分离；L-TAMs富集免疫调节、组织重塑、清道夫功能、补体激活、受体介导内吞、血管生成及小GTP酶信号通路，并高表达CD163、MRC1（CD206）、CD274、CCL18、LYVE1、VSIG4、SIGLEC1；S-TAMs富集炎症反应、白细胞介素-1（interleukin-1, IL-1）信号、白细胞趋化、T细胞分化与活化等通路，并高表达IL1B、IL1R1、S100A8、S100A9、FCN1、CD300E、VCAN、AQP9；独立队列（n=4）RT-qPCR验证S-TAMs的IL1β较高、L-TAMs的CCL18和CD206较高。
Generation of S-TAM-like and L-TAM-like macrophage models using tumour cell-derived conditioned media：研究人员用患者来源CRLM肿瘤细胞条件培养基处理巨噬细胞，按肿瘤IHC所示TAM形态分层；L-TAM富集肿瘤条件培养基诱导L-TAM样特征，即免疫调节相关基因和CD206表达升高、细胞较大且不规则；S-TAM富集肿瘤条件培养基诱导更炎症性表型、S100A8表达升高、细胞较小较圆且CD206较低；CD274（编码PD-L1）在L-TAM富集条件培养基处理的巨噬细胞中升高。
Cytokines released by patient-derived CRLM cells：研究人员对24例原代CRLM细胞培养上清行细胞因子谱分析，检测到IL-6、IL-8、CCL2、CCL4、CCL11、CXCL10、TNF-α和VEGF等分泌因子；按TAM形态分层后，S-TAM富集肿瘤上清中IL1β、IL9、CXCL10和CCL4较高，L-TAM富集肿瘤上清中CCL2较高。
LSD1 inhibition reshapes TAM phenotype and counteracts tumour-induced macrophage reprogramming：研究人员先确定baicalin（25 μM）和INCB059872（1000 nM）的无毒工作浓度，再处理体外生成的经典TAMs（classical TAMs, c-TAMs）；LSD1抑制后炎症相关基因IL1B、S100A8上调，免疫调节/TAM样基因CCL18、CD206下调，细胞由细长刺状转为较小圆形，细胞面积降低，INCB059872处理组圆度增加；在肿瘤条件培养基诱导的TAM模型中，baicalin或INCB059872降低CD206基因和蛋白表达、增加细胞圆度，并降低CD274/PD-L1表达，尤其在L-TAM富集条件培养基处理的巨噬细胞中更明显。

讨论部分总结：讨论强调CRLM的肿瘤诱导免疫重塑延伸至转移灶外，使瘤周肝组织成为富含肿瘤条件化免疫调节巨噬细胞的特殊免疫微环境。瘤周CD68-high巨噬细胞积累与L-TAMs共享细胞增大和CD163升高特征；转录组分析表明形态学定义的S-TAM/L-TAM对应不同功能状态，而非新的分类学或谱系来源，CD68-dim巨噬细胞则呈异质性并包含HLA-DR-high细胞。L-TAMs富集组织重塑、受体介导内吞、补体激活和血管生成通路，并高表达MRC1、CD274、CCL18、VSIG4、LYVE1等免疫调节基因；S-TAMs富集IL-1信号、趋化、T细胞活化和炎症反应程序。肝脏巨噬细胞生物学复杂， resident Kupffer细胞和微环境信号可被转移灶重编程；巨噬细胞来源与功能极化相互关联但不可互换，S-TAM/L-TAM应视为形态学定义的功能状态，其发育关系尚不能在本队列中解决。CRLM细胞分泌的CCL2、IL-6、IL-8、VEGF等可促进单核细胞募集、存活、M2样极化和血管生成，形成肿瘤细胞教育髓系细胞、后者再释放IL-6、VEGF、基质蛋白酶和免疫检查点以促进转移和T细胞抑制的自我强化环路；CCL2在L-TAM优势肿瘤中富集，S-TAM优势肿瘤则IL-1β、CXCL10、CCL4、IL-9较高。表观遗传调控是巨噬细胞身份和功能的关键机制，LSD1抑制选择性减弱免疫调节相关特征而保留多数炎症相关基因表达，提示其主要维持免疫调节转录程序；LSD1抑制后PD-L1降低，提示其调控巨噬细胞免疫检查点表达，但是否增强T细胞功能或改善ICB反应尚待确定。转化上，LSD1是调节转移性微环境中巨噬细胞功能的候选靶点；LSD1抑制联合PD-1/PD-L1阻断在CRLM尚未确立，其他肿瘤的临床前研究和早期临床试验（小细胞肺癌，NCT06287775）支持表观遗传-髓系靶向的广泛相关性。局限性包括PD-L1降低对T细胞活化和抗肿瘤免疫的影响需更复杂实验系统验证，LSD1对巨噬细胞空间组织及S-TAM/L-TAM谱系或相互转化尚需谱系追踪、纵向研究、患者来源类器官、多细胞共培养和体内模型。

研究结论翻译：总之，研究人员的发现表明，形态学不同的TAMs代表CRLM瘤周微环境中功能上不同的巨噬细胞状态。L-TAMs显示与免疫调节状态一致的转录和表型程序，并与不良临床结局相关；而S-TAMs表现出更炎症性的特征。药理学抑制LSD1减弱巨噬细胞部分免疫调节特征，包括CD206和PD-L1表达，支持LSD1在维持巨噬细胞可塑性中的作用。总之，这些发现将LSD1定位为转移性免疫微环境中有前景的表观遗传调控因子，并为未来探索其治疗潜力（单独或联合免疫调节策略）提供依据。