姜黄素类似物FLLL32通过靶向STAT3-GPX4/SLC40A1轴诱导结直肠癌细胞铁死亡

《Molecular Biomedicine》：Curcumin analogue FLLL32 induces ferroptosis by targeting the STAT3-GPX4/SLC40A1 axis in colorectal cancer

　　

FLLL32是一种姜黄素类似物，已有报道其具有抗肿瘤活性，主要通过抑制信号转导与转录激活因子3（STAT3）信号并诱导凋亡实现。然而，FLLL32是否调控结直肠癌（CRC）中的铁死亡（ferroptosis）及其潜在机制仍不清楚。在此，研究人员利用患者来源CRC类器官（PDOs）筛选平台，鉴定FLLL32为一种强效抗CRC化合物。FLLL32抑制CRC类器官生长，在体外抑制CRC细胞增殖和迁移，并在体内抑制异种移植瘤生长。同时，FLLL32诱导铁死亡相关铁积累、活性氧（ROS）产生、脂质过氧化以及线粒体形态和功能异常。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）显著恢复FLLL32损伤的细胞活力并降低ROS，而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK保护作用较弱。这些发现表明，铁死亡是FLLL32诱导细胞死亡的主要贡献者，尽管凋亡特征也存在。机制上，FLLL32与STAT3相互作用，Glu⁶³⁸和Met⁷²⁶参与FLLL32-STAT3相互作用。FLLL32还抑制STAT3 Tyr⁷⁰⁵磷酸化和核信号，从而破坏pSTAT3介导的谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和溶质载体家族40成员1（SLC40A1）转录调控，削弱脂质过氧化物解毒和细胞铁外排，促进细胞内铁积累，并增强CRC细胞铁死亡。这些发现界定了FLLL32抗CRC活性背后的STAT3-GPX4/SLC40A1依赖性机制，并支持进一步研究STAT3相关铁死亡调控作为CRC潜在治疗脆弱性。

研究背景：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是常见恶性肿瘤和癌症相关死亡的重要原因。尽管手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗改善了临床管理，但治疗抵抗、肿瘤复发和不良反应仍限制疗效，尤其晚期或转移性患者。因此，寻找有效且低毒的治疗药物仍是CRC治疗的重要目标。患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）保留原肿瘤的组织学、遗传学和药物反应特征，较传统细胞系更能保留患者间异质性，适合功能性药物筛选。姜黄素具有抗肿瘤活性，但溶解度差、生物利用度低和药理学稳定性有限；FLLL32是结构修饰的姜黄素类似物，作为STAT3靶向抑制剂具有更好的结合效力和选择性，既往研究主要强调其抑制STAT3磷酸化、DNA结合活性及诱导凋亡。铁死亡（ferroptosis）是铁依赖性氧化触发的调节性细胞死亡，以脂质过氧化物过度积累、铁稳态破坏和抗氧化防御受损为特征；GPX4、SLC7A11和铁转运蛋白等参与调控，其中谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）还原磷脂氢过氧化物，溶质载体家族40成员1（solute carrier family 40 member 1, SLC40A1，亦称ferroportin）介导铁外排。STAT3在CRC中常被激活，Tyr⁷⁰⁵磷酸化后二聚化并核转位调控靶基因；近期研究将STAT3信号与铁死亡调控尤其是GPX4转录控制联系起来，但STAT3是否同时协调脂质过氧化物解毒和铁外排尚不清楚。基于此，研究人员利用CRC PDOs筛选平台鉴定FLLL32的抗CRC活性，并研究其是否通过STAT3-GPX4/SLC40A1轴诱导铁死亡。该论文发表于《Molecular Biomedicine》。

研究人员为开展研究采用的主要关键技术方法包括：建立6例未接受术前放化疗的结直肠腺癌患者手术标本来源的CRC类器官（标本来自四川大学华西医院），构建384孔板高通量药物筛选平台；采用细胞活力、EdU掺入、划痕愈合、流式细胞术、JC-1、FerroOrange、Liperfluo、DCF、总铁比色、RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）、Western blot、染色质免疫沉淀定量PCR（chromatin immunoprecipitation quantitative PCR, ChIP-qPCR）、启动子荧光素酶报告、分子对接、生物层干涉（bio-layer interferometry, BLI）、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）/H评分（H-score）以及HCT116皮下异种移植模型等。

研究结果：（1）患者来源CRC类器官筛选鉴定FLLL32为候选抗CRC化合物：研究人员通过6例PDOs的384孔板化合物库筛选发现FLLL32在6例PDOs中均抑制生长；细胞活力实验显示其对HCT116和HT29的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.44 μM和0.33 μM，对NCM460正常结肠上皮细胞在5 μM以下毒性较小；剂量梯度免疫印迹显示pSTAT3下降，据此选择1 μM和1.5 μM用于后续机制实验，结论为FLLL32是候选抗CRC化合物。（2）FLLL32抑制CRC细胞增殖和迁移：通过EdU掺入、划痕愈合、Western blot和流式细胞术发现FLLL32减少EdU阳性细胞、抑制迁移、降低N-cadherin和vimentin并增加E-cadherin、改变细胞周期，Annexin V/PI显示凋亡群体增加，结论为FLLL32抑制增殖迁移、干扰细胞周期并促进凋亡特征。（3）FLLL32诱导CRC细胞铁死亡相关特征：通过RNA-seq和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集发现铁死亡通路富集且铁死亡相关基因表达改变；透射电子显微镜（TEM）显示线粒体膜密度增加、嵴减少或消失；Liperfluo、DCF、总铁比色、FerroOrange和JC-1显示脂质过氧化、ROS、总铁和Fe²⁺增加及线粒体膜电位异常，结论为FLLL32诱导铁死亡相关生化与线粒体特征。（4）FLLL32在CRC细胞中诱导可被Fer-1挽救的铁死亡反应：通过抑制剂挽救实验发现Fer-1较Z-VAD-FMK更有效恢复FLLL32降低的细胞活力，并降低ROS和Fe²⁺、部分恢复克隆形成；RT-qPCR和Western blot显示GPX4/SLC40A1下降、铁蛋白重链1（FTH1）/铁蛋白轻链（FTL）上升；时间进程显示GPX4/SLC40A1早期下降而铁蛋白后期上升，FTH1/FTL敲低增强FLLL32诱导的脂质过氧化，结论为铁死亡是FLLL32诱导细胞死亡的重要功能成分，铁蛋白上调为适应性铁缓冲反应。（5）FLLL32靶向STAT3抑制pSTAT3介导的GPX4/SLC40A1转录调控：通过Western blot和核质分离发现FLLL32降低STAT3 Tyr⁷⁰⁵磷酸化及核pSTAT3而不改变总STAT3；ChIP-qPCR显示pSTAT3在GPX4和SLC40A1启动子占位降低；启动子荧光素酶实验显示STAT3激活野生型启动子而结合基序突变取消激活，FLLL32抑制野生型而对突变型作用减弱；分子对接和BLI显示FLLL32与STAT3结合，Glu⁶³⁸/Met⁷²⁶突变减弱结合，STAT3-TB2部分保留pSTAT3/GPX4/SLC40A1并减弱FLLL32诱导的脂质过氧化和生长抑制，结论为FLLL32直接靶向STAT3并抑制pSTAT3介导的GPX4/SLC40A1转录。（6）恢复STAT3-GPX4/SLC40A1轴减弱FLLL32诱导的CRC细胞铁死亡：通过STAT3敲低、回补和过表达实验发现STAT3敲低降低GPX4/SLC40A1并增加Fe²⁺和脂质过氧化，STAT3回补可恢复；STAT3过表达部分逆转FLLL32诱导的GPX4/SLC40A1下降和ROS；GPX4和/或SLC40A1过表达降低FLLL32诱导的脂质过氧化，结论为STAT3-GPX4/SLC40A1轴功能参与FLLL32诱导的铁死亡。（7）FLLL32抑制CRC异种移植瘤生长：通过HCT116皮下异种移植BALB/c-nu/nu小鼠给予FLLL32 50 mg/kg/day腹腔注射发现肿瘤体积和重量下降；IHC显示Ki67、pSTAT3和GPX4降低，Western blot显示pSTAT3、GPX4和SLC40A1降低而总STAT3不变；体重无显著差异，主要器官苏木精-伊红（H&E）染色无明显组织毒性，结论为FLLL32在体内抑制CRC生长并抑制STAT3-GPX4/SLC40A1轴。

讨论部分总结：讨论指出，FLLL32既往主要被视为STAT3靶向并具促凋亡活性的化合物；本研究中凋亡特征确实存在，但Fer-1对细胞活力的挽救强于Z-VAD-FMK，并部分恢复克隆形成、降低ROS和Fe²⁺积累，提示铁死亡是FLLL32抗CRC活性的重要功能成分，FLLL32诱导的CRC细胞死亡应理解为凋亡与铁死亡共存的 multilayered 调节性细胞死亡反应。机制上，FLLL32直接结合STAT3，抑制Tyr⁷⁰⁵磷酸化和核pSTAT3信号，降低pSTAT3在GPX4和SLC40A1启动子的占位及STAT3诱导的启动子活性，抑制GPX4/SLC40A1转录；GPX4下降削弱脂质过氧化物解毒，SLC40A1下降限制铁外排并增加细胞内不稳定铁池，二者共同破坏铁-脂质过氧化物稳态、放大氧化损伤。FTH1/FTL后期上调更像FLLL32诱导铁死亡应激下的适应性铁缓冲反应，而非与铁死亡诱导相矛盾。意义在于，PDOs筛选平台提供了临床相关系统，研究将STAT3抑制与GPX4/SLC40A1介导的铁死亡防御联系起来，提示STAT3-GPX4/SLC40A1轴可能是CRC铁死亡导向治疗的潜在脆弱性。局限包括：未检测临床CRC样本中GPX4和SLC40A1表达；异种移植模型为免疫缺陷小鼠，无法评估FLLL32诱导铁死亡与抗肿瘤免疫的相互作用；毒性评价主要基于主要器官组织病理，仍需血液学、肝肾功能血清生化、长期毒性及正常结肠类器官验证；虽BLI和突变分析支持FLLL32与STAT3直接结合，但缺乏细胞热位移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）等细胞靶engagement实验。

研究结论翻译：本研究鉴定FLLL32为一种活性抗CRC化合物，并界定FLLL32诱导铁死亡的STAT3-GPX4/SLC40A1依赖性机制。FLLL32直接靶向STAT3，抑制STAT3 Tyr⁷⁰⁵磷酸化及pSTAT3依赖性核信号，降低GPX4/SLC40A1转录调控，破坏铁-脂质过氧化物稳态，从而促进铁依赖性脂质过氧化和铁死亡细胞死亡。这些发现为FLLL32抗CRC活性提供机制基础，并突出STAT3-GPX4/SLC40A1轴作为相关铁死亡防御通路，值得在CRC中进一步研究。