柑橘花与刺早期发育分化的比较转录组解析及CsAP1在刺生长中的功能验证

《Horticulture Advances》：Transcriptional analysis of flower and thorn development in Citrus

　　

尽管刺和花均起源于决定型茎尖分生组织（determinate shoot meristems），但它们发育为形态学上不同且生物学功能各异的结构。然而，其早期发育分化的分子机制在很大程度上仍不清楚。本研究对枳橙（citrange）幼刺、幼花及相邻茎进行了比较转录组分析，以解析与这两种决定型茎尖类型相关的调控程序。研究人员鉴定出480个花偏好表达基因和400个刺偏好表达基因。花偏好表达基因包括参与花发育的典型MADS-box基因（如APETALA3（CsAP3）、PISTILLATA（CsPI）、AGAMOUS（CsAG）和SEPALLATA3（CsSEP3））、花分生组织身份基因LEAFY（CsLFY），以及已知的雄蕊（如DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1（CsDYT1）和ABORTED MICROSPORES（CsAMS））和果实发育（如CRABS CLAW（CsCRC））调控因子。刺偏好表达基因包括刺身份基因TI1、TI2和TI3，以及刺尖硬化调控因子SHORT AND SOFT THORN 1（SST1）及其下游靶标（如NAC secondary wall thickening promoting factor 1（CsNST1）和secondary wall-associated NAC domain protein 1（CsSND1））。令人惊讶的是，A类花发育基因CsAP1和CsAP2.1在幼刺中优先表达，若干MADS-box基因，包括SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）同源基因和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）样基因，也表现出刺偏好表达。利用CRISPR-Cas9介导的敲除进行功能分析表明，CsAP1缺失导致刺显著缩短，表明该花身份基因在刺生长中发挥作用。总之，研究结果为了解刺和花的发育程序提供了新见解，并为柑橘（Citrus）中这些茎尖类型的定向改良提供了候选基因。

开花植物演化出多样的茎系统，以平衡繁殖与防御需求。茎尖分生组织（shoot apical meristem, SAM）在营养发育阶段产生叶，而在花转变后转化为花序分生组织并产生花；部分物种的茎分生组织还可产生刺，刺为改良枝，具有抵御生物与非生物胁迫的保护功能。刺与花形态不同，但均源于决定型茎尖分生组织（determinate shoot meristems），其共同遗传机制如何被重编程以形成不同结构尚不清楚。花发育在拟南芥等模式物种中已有系统研究，ABCE模型及LFY、AP1、AG、SEP3等调控花器官身份与分生组织决定型；柑橘刺则成为研究营养型决定型茎尖分生组织的可处理模型，TI1、TI2、TI3、SST1、CsCEN等参与刺身份、刺尖硬化及腋生分生组织不确定性维持。柑橘幼年期长，开花后刺产生减少或消失，刺与花可能是决定型茎尖发育的替代结果，但此前缺乏刺与花的直接转录组比较。为此，研究人员对23年生卡里佐枳橙（Carrizo citrange）的幼刺、幼花芽及相邻茎进行高通量RNA-seq，鉴定花偏好和刺偏好基因，并意外发现A类花发育基因CsAP1和CsAP2.1在幼刺中优先表达；进一步用CRISPR-Cas9敲除CsAP1，发现突变体刺显著缩短，表明该花身份基因参与刺生长。该研究为理解刺与花早期发育分化提供了新见解，并为柑橘茎尖类型定向改良提供候选基因。

关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源为种植于华中农业大学柑橘种质资源中心的23年生卡里佐枳橙树；于全花期春梢活跃期采集非木质化幼刺（长度≤0.5 cm）、幼花芽及相邻茎，每类3个生物学重复。采用Illumina HiSeq进行RNA-seq，reads经fastp过滤后比对Citrus sinensis v2.0 CPBD，以StringTie定量、DESeq2鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs；阈值|log₂FC|>2、P_adj<0.05），并进行qRT–PCR验证；用CRISPR-Cas9（一种RNA引导的基因组编辑技术）敲除CsAP1和CsBP1，HI-TOM检测编辑效率；对CsBP1进行RNA原位杂交（RNA in situ hybridization），并进行木质素染色与组织切片；GraphPad Prism 8作统计分析。

研究结果：（1）柑橘幼刺、幼花和茎的转录组特征：通过对23年生枳橙的幼刺、幼花芽和相邻茎进行RNA-seq，获得66.65 Gb clean data，Q30均超过97%，平均每样本4950万reads，比对率84–87.45%；主成分分析中PC1区分花与其他组织，PC2区分刺与茎，3个生物学重复相关系数r>0.98，表明三组织转录组差异显著且数据可靠。（2）花偏好表达基因包括CsLFY但不包括CsAP1或CsAP2：通过刺与花直接比较，在|log₂FC|>2、P_adj<0.05条件下鉴定880个DEGs，其中480个花偏好、400个刺偏好，并筛选出63个花特异转录因子（transcription factor, TF）和51个刺特异TF；花偏好基因包括CsLFY、AP3.1/AP3.2、PI、AG、SEP3/AGL9、SEP2同源基因、AGL32.1（ABS）、AGL18、SHP1，以及雄蕊发育相关CsMYB35/TDF1、CsDYT1、CsAMS1/2、bHLH091，花瓣相关CsbHLH161/BNQ3，果实和蜜腺相关CsCRC、CsYABs，WOX家族CsWUS、CsWOX1、CsWOX9；qRT–PCR验证了MADS-box和WOX基因表达；意外的是AP1和AP2未表现花特异表达；基因本体（Gene Ontology, GO）富集于花器官形成、雄蕊形成、花器官身份决定、花药发育、花药壁绒毡层发育和花轮发育。结论是花偏好基因覆盖花器官身份与发育程序，但A类AP1/AP2并不在花中特异富集。（3）刺偏好转录因子包括CsAP2.1：通过刺与花比较，发现TI1、TI2、TI3在刺中显著高表达，SST1及其下游NST1、NST3/SND1和若干MYB基因表达与刺尖次生细胞壁沉积和硬化一致；GO富集于植物型次生细胞壁生物合成和木质素生物合成；刺偏好MADS-box基因包括3个SVP同源基因CsAGL22.1/2/3和SOC1样基因CsAGL19、CsAGL20、CsAGL42；CsBP和CsWOX4在刺中优先表达；CsAP2.1在刺中表达约为花的8倍，qRT–PCR验证了刺相关基因表达模式。结论是刺偏好基因涉及刺身份、刺尖硬化、次生壁形成及部分MADS-box调控因子。（4）A类基因CsAP1也在刺中优先表达：通过比较刺和花相对茎的上调基因，获得369个核心共享基因，其中46个TF，包括AP1、RSB1（AGL6）、SEP1（AGL2）和AGL15；AP1和RSB1在刺中表达接近花中2倍，SEP1和AGL15在花中更高，4个MADS-box基因在茎中表达很低；TCP2、TCP4、CUC2和LOB也在刺和花中表达，qRT–PCR验证了核心TF表达。结论是刺和花共享部分决定型侧生器官发育调控因子，CsAP1在刺中高表达。（5）CsAP1参与刺生长：RNA-seq和qRT–PCR均显示CsAP1在刺中显著高于茎，且为花中表达2倍；用特异gRNA敲除CsAP1获得4个完全突变系，Csap1突变体刺显著短于野生型；木质素染色显示刺尖木质素积累相似，纵切显示细胞长度无明显差异。结论是CsAP1参与柑橘刺生长，短刺并非由细胞伸长受损或木质化降低导致。（6）CsBP1参与刺发育但可能与其他基因功能冗余：CsBP1为刺偏好KNOX基因，RNA原位杂交显示其在SAM、幼茎和发育中的刺中检测到，而在叶原基或苞片原基中未检测到；CRISPR-Cas9敲除获得2个完全突变体和1个编辑效率94.14%的植株，但Csbp1突变体无明显发育异常。结论是CsBP1在刺发育中表达，但敲除无明显表型，可能源于KNOX家族功能冗余（functional redundancy，指同源基因间可相互补偿）。

讨论部分总结：比较转录组揭示刺与花抑制CsWUS的机制不同，刺中由TI基因介导，花中可能由CsAG介导；CsLFY是区别于刺的关键花调控因子，激活AG、SEP3及花器官发育基因；A类基因CsAP1和CsAP2在发育中的刺中表达，CsAP1敲除导致刺缩短，说明花身份基因可能参与刺这一特化枝结构的生长调控。尽管刺与花形态差异显著，二者共享部分决定型侧生器官发育调控因子。多年生木本植物中花身份基因在营养发育中的功能分化可能与环境适应策略有关；拟南芥中A、B、C类基因在叶等营养组织中被抑制以避免干扰叶发育，而多年生植物需整合季节生长周期；杂交白杨中LAP1促进分枝并抑制BRC1、调节细胞分裂素信号，AP2样蛋白参与季节生长停滞。CsAP1、CsAP2与刺身份基因TI1/2的关系是未来重要方向。TI1/2/3和CsLFY分别是区分刺与花发育的关键决定因子：TI1/2/3部分通过抑制CsWUS终止分生组织活性，并激活SST1促进刺尖硬化和终末分化；刺中缺乏CsLFY表达可解释其下游CsAG、CsSEP3、CsPI等花器官身份基因不表达；CsSEP1在刺中表达，与AtAGL6调控腋芽分枝的作用一致；LFY过表达可诱导柑橘开花并显著减少刺，提示激活花发育程序可使腋生分生组织命运由营养型刺发育转向生殖身份。结论部分翻译：本研究揭示A类基因CsAP1在营养枝（刺）和生殖枝（花）中均发挥调控作用。CsLFY是区分花身份与刺身份的关键分子开关，并特异性激活B、C、E类基因以建立雄蕊和心皮身份。相反，TI1/2/3作为刺身份基因，确保刺的决定型生长，并通过NAC和MYB转录因子促进刺尖次生细胞壁生物合成程序。