《Calcified Tissue International》：CD274 Knockout Promotes Bone Formation and Reduces Osteoclast Activity
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骨质疏松症是一种全身性疾病，其特征是骨密度下降以及骨组织微结构重塑的退化，导致骨折易感性增加。参与骨代谢的一个分子是程序性死亡配体1（PD-L1），这是一种由基因Cd274编码的药理学可靶向免疫检查点分子。本研究的目的是在放射学、组织学和生物力学水平上，比较2
骨质疏松症是一种全身性疾病，其特征是骨密度下降以及骨组织微结构重塑的退化，导致骨折易感性增加。参与骨代谢的一个分子是程序性死亡配体1（PD-L1），这是一种由基因Cd274编码的药理学可靶向免疫检查点分子。本研究的目的是在放射学、组织学和生物力学水平上，比较26周龄的Cd274基因敲除（KO）小鼠与C57BL/6J对照野生型小鼠的骨表型。结果显示，Cd274 KO小鼠股骨和胫骨的皮质壁厚度和皮质体积显著增加，而骨小梁间隙显著减小。此外，Cd274 KO小鼠腰椎的骨体积分数（BV/TV）和骨小梁体积也显著增加。Cd274 KO小鼠股骨的屈服载荷、刚度及无机物含量显著升高，而有机物含量则显著降低。同时，在Cd274 KO小鼠的肱骨和腰椎中观察到骨细胞数量显著增多，破骨细胞数量显著减少。研究结果表明，Cd274的组成性敲除与骨量和骨强度的显著增加相关。这些在健康、骨骼成熟的组成性敲除小鼠中获得的结果表明，在缺乏Cd274的情况下骨表型得到改善，因此与先前将PD-1/PD-L1轴阻断（包括免疫检查点抑制剂治疗）与骨质流失和骨折风险增加相关联的研究形成对比。在得出转化医学结论之前，还需要进一步的研究，特别是在专门的骨质疏松模型中，以阐明CD274对骨代谢的影响。
研究背景
骨质疏松症是一种以骨密度降低和骨组织微结构退化为特征的全身性疾病，最终导致骨折风险增加。该病的病理生理基础在于骨吸收超过骨形成，这一失衡随年龄增长而加剧。现有治疗药物如双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、地诺单抗和特立帕肽等存在副作用、长期疗效减退或在部分患者中无效等问题，因此开发新型抗骨质疏松药物具有重要意义。研究人员此前发现，来自骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞（BMSCs）中程序性死亡配体1（PD-L1，由基因CD274编码）的表达水平显著低于健康对照组，提示PD-L1可能在骨代谢调控中发挥作用。然而，关于PD-L1缺失对骨骼的确切影响尚存争议——临床研究显示免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗可能增加骨折风险，但也有实验证据表明PD-1/PD-L1通路阻断可抑制破骨细胞生成。为此，本研究旨在通过系统性评估Cd274基因敲除（KO）小鼠在放射学、组织学和生物力学层面的骨表型，探讨PD-L1缺失对骨骼的影响。
研究方法与关键技术
研究人员使用了26周龄的B7-H1-/- Cd274 KO小鼠（由Prof. Schirmbeck提供）和26–34周龄的C57BL/6J对照小鼠（购自Janvier Labs）。主要技术方法包括：① 微型计算机断层扫描（micro-CT，Siemens Inveon μCT）用于测量股骨、胫骨和第五腰椎（L5）的骨形态参数；② 三点弯曲生物力学测试（Zwick试验机）评估股骨的屈服载荷和刚度；③ 灰化法测定股骨的有机和无机物含量；④ 组织学染色分析，包括Light Green/Safranin O染色计数骨细胞和软骨、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数破骨细胞、五色染色评估矿化骨，并使用开源软件TrapHisto进行半自动骨吸收参数分析。所有数据采用未配对t检验进行统计分析，显著性水平设为p ≤ 0.05。
研究结果
增强的皮质壁厚度、皮质体积及减少的骨小梁间隙：Micro-CT分析显示，Cd274 KO小鼠胫骨干骺端皮质壁厚度（0.565 mm vs. 0.426 mm, p=0.016）和股骨干骺端皮质壁厚度（0.298 mm vs. 0.253 mm, p=0.011）均显著高于对照组。股骨干骺端皮质体积在KO组中也显著增大（3.920 mm3 vs. 3.370 mm3, p<0.001）。胫骨和股骨骨骺端的骨小梁间隙在KO组中均显著减小（胫骨：0.033 mm vs. 0.043 mm, p=0.015；股骨：0.036 mm vs. 0.052 mm, p=0.037）。
增强的腰椎骨体积分数（BV/TV）和骨小梁体积：Cd274 KO小鼠腰椎的骨小梁体积（3.126 mm3 vs. 2.331 mm3, p=0.009）和BV/TV（0.573 vs. 0.456, p<0.001）均显著高于对照组，而股骨和胫骨的BV/TV无显著差异。
增强的屈服载荷、刚度及无机物含量，降低的有机物含量：生物力学测试表明，Cd274 KO小鼠股骨的屈服载荷（18.32 N vs. 12.17 N, p=0.0016）和刚度（82.41 N/mm vs. 51.37 N/mm, p=0.0006）均显著高于对照组。灰化分析显示，KO组股骨的无机物含量显著升高（40.08% vs. 35.69%, p=0.038），有机物含量则显著降低（59.92% vs. 64.31%, p=0.038）。
组织学评估：组织学分析显示，Cd274 KO小鼠腰椎的矿化骨比例显著高于对照组（16.82% vs. 11.01%, p=0.014），但肱骨和股骨的矿化骨比例无显著差异。KO组肱骨（1102/mm2 vs. 868.8/mm2, p=0.036）和腰椎（340.9/mm2 vs. 225.2/mm2, p<0.01）中的骨细胞数量显著增多，而肱骨（26.4/mm2 vs. 32.83/mm2, p=0.044）和腰椎（90/mm2 vs. 141.7/mm2, p=0.002）中的破骨细胞数量显著减少。股骨的破骨细胞数量虽有下降趋势但未达统计学意义。各组间的破骨细胞表面与骨表面比值（Oc.S/BS）无显著差异。软骨百分比和骨髓脂肪细胞参数在两组间也无显著差异。
讨论与结论
本研究的假设基于前期发现——骨质疏松患者BMSCs中CD274表达降低——预期Cd274 KO小鼠会表现出更低的骨量，但实际结果恰恰相反：Cd274的组成性敲除与骨量和骨强度显著增加相关。这一结果与Greisen等人（8周龄雄性PD-L1 KO小鼠表现为骨面积和皮质厚度减少）以及Schildberg等人（PD-1和PD-L1 KO小鼠骨密度降低）的报道相矛盾，但与Nagahama等人（12周龄PD-1 KO小鼠骨小梁体积增加）的研究一致。研究人员认为，这种差异可能与动物年龄、性别、发育阶段以及检测部位不同有关。本研究中26周龄小鼠反映的是终身缺乏PD-L1后骨骼生长、建模和重塑的累积效应，而非单纯成熟骨骼重塑的变化。值得注意的是，临床研究中ICI使用者骨折率增加的观察结果可能受到癌症本身对骨骼健康的影响，而Gassner等人的研究则显示ICI可短暂降低骨吸收标志物并增加骨形成标志物，提示潜在的保护作用。本研究首次比较了Cd274 KO小鼠的生物力学特性，发现屈服载荷和刚度显著增加，这与皮质骨增厚和骨小梁间隙缩小一致。骨细胞数量增多和破骨细胞数量减少共同解释了骨量和骨强度的提升。研究局限性包括：样本量有限、仅涉及单一年龄组、未进行分子机制分析、未控制性别因素，以及使用的是健康成年小鼠的组成性敲除模型而非骨质疏松模型。因此，在得出转化医学结论之前，需要在专门的骨质疏松模型（如卵巢切除诱导或年龄相关性骨质疏松）中进行进一步研究，并结合动态组织形态计量学和循环骨转换标志物（如P1NP和CTX）分析。
结论：综上所述，Cd274基因敲除小鼠在骨形态、力学性能和细胞组成方面表现出显著变化，将Cd274确定为骨表型的调节因子。这些发现为进一步研究骨-免疫相互作用的分子机制奠定了基础。其治疗相关性仍需在专门的骨质疏松模型中加以确定，才能就PD-L1抑制是否能增强骨密度或降低骨折风险得出结论。
