肝内胆管癌单细胞与空间转录组学解析的空间免疫生态、代谢重塑及免疫治疗启示

《Frontiers in Immunology》：Single-cell and spatial transcriptomics in intrahepatic cholangiocarcinoma: spatial immune ecosystems, metabolic remodeling, and immunotherapeutic implications

肝内胆管癌（iCCA）是一种侵袭性肝脏恶性肿瘤，具有显著的细胞、空间和代谢异质性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）正开始通过将恶性、免疫、基质和代谢状态与其组织背景相联系来解析这一复杂性。本综述综合了近期iCCA单细胞和空间研究，涵盖四个空间背景：包含三级淋巴结构（TLSs）的适应性免疫区域、侵袭前沿由基质细胞和髓系细胞形成的屏障、缺氧塑造的髓系生态位，以及涉及免疫细胞和基质细胞的转移生态系统。这些生态位将肿瘤异质性与免疫调节、基质重塑、代谢适应和治疗易感性联系起来。研究人员还评估了代谢与免疫之间的串扰如何塑造巨噬细胞极化、T细胞功能障碍和治疗反应，同时区分计算推断的相互作用与功能支持的机制。因此，该领域正从编目更多细胞状态和空间生态位，转向确定哪些生态系统特征在队列间可重复、机制上得到支持、临床可测量并对治疗反应具有信息价值。当前证据支持将iCCA视为一种空间组织化和代谢调控的肿瘤生态系统，可指导生物标志物开发及合理的免疫治疗策略。

1 引言：iCCA全球发病率上升，诊断时多为中晚期，手术切除机会有限，放化疗和常规靶向治疗反应有限，即使引入免疫检查点抑制剂，5年总生存率仍低。肿瘤间和肿瘤内异质性显著，传统bulk转录组受平均效应限制并丢失空间背景；scRNA-seq（单细胞RNA测序）可解析细胞亚型、分化轨迹和功能状态，但组织解离破坏空间信息；ST（空间转录组学）将基因表达映射至完整组织坐标，保留空间背景。本综述以生态系统为中心整合scRNA-seq和ST证据，考察iCCA异质性相关的空间免疫组织、代谢重塑和治疗易感性。
2 单细胞RNA测序与空间转录组学：scRNA-seq与ST互补。bulk转录组仍可用于定义主导分子程序，但会平均化肿瘤、免疫和基质信号；scRNA-seq可分辨稀有群体、过渡状态和谱系相关程序，但解离会改变转录程序并丢失空间关系，因此主要提供高分辨率细胞证据和机制假设。ST保留组织架构，分为基于成像和基于测序的策略：成像型ST（如MERFISH、Xenium、CosMx、STARmap、seqFISH⁺）空间精度高，适合肿瘤边界、免疫聚集、巨噬细胞–成纤维细胞界面和TLSs（三级淋巴结构）等结构，但多依赖靶向基因 panel，细胞水平准确性受探针、图像质量、组织保存和转录本–细胞分配影响；测序型ST（如Visium衍生平台、Stereo-seq、Slide-seqV2等）转录组覆盖更广，适合探索性分析，但空间单元可能混合邻近细胞、细胞碎片和细胞外RNA。空间分辨率不等同于真正单细胞分辨率，准确分配转录本依赖核/膜分割。整合策略包括反卷积和空间映射，可重建组织区域细胞组成或将scRNA-seq定义状态投射至组织坐标，但仍属推断且依赖参考图谱完整性、平台兼容性、采样、分割质量、批次效应和相近状态转录相似性。空间共定位和配体–受体兼容性可提名候选互作，组织学、免疫染色、多重成像、功能扰动和临床关联可逐级增强证据。
3 空间组织的iCCA免疫生态系统：空间 profiling 将TME（肿瘤微环境）从免疫细胞集合转变为解剖学定义生态位中的空间组织生态系统，包括TLS相关适应性免疫区域、侵袭前沿肿瘤–基质界面、缺氧相关髓系生态位及原发和转移部位髓系–肿瘤生态系统。
3.1 三级淋巴结构：位置和情境依赖的适应性免疫：TLSs是异位淋巴聚集体，可支持B细胞成熟、抗体产生和局部抗原驱动免疫反应。研究显示瘤内TLS与较好生存相关，而高瘤周TLS评分与较差结局相关，整合两个空间评分可区分不同预后免疫类别；大导管型iCCA中瘤内和瘤周高密度TLS均与生存延长相关，瘤周TLS在该组织学亚型中保留预后意义。瘤内TLS富集CD4⁺ BCL6⁺ Tfh（滤泡辅助性T细胞）和CD4⁺ FOXP3⁺ Tregs（调节性T细胞）；Treg频率与不良预后瘤周TLS评分相关而非有利瘤内TLS评分相关。B细胞在邻近无瘤组织中富集，成熟TLS与良好预后相关；肿瘤浸润B细胞较少，IL-10和TGF-β表达增加，肿瘤细胞或CAFs（癌症相关成纤维细胞）经IL-6和TGF-β损害B细胞分化并降低BAFFR⁺表达，联合阻断可恢复B细胞活化和分化；循环BAFFR⁺ B细胞频率升高和B细胞克隆扩增与化疗免疫治疗反应改善相关。VEGF阻断可通过BAFF和IL-12依赖机制增强抗CTLA-4和抗PD-L1治疗并促TLS形成。TLS丰度本身不足以描述适应性免疫组织，位置、成熟度、Tfh/B细胞组织和B细胞功能更重要。
3.2 侵袭前沿：肿瘤、基质和免疫区室的协调重塑：侵袭前沿是恶性实质与周围肝组织的过渡界面，肿瘤细胞、CAFs、内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞在此空间组织。侵袭边缘恶性细胞呈EMT（上皮–间质转化）、缺氧、血管生成和脂代谢相关程序增强，增殖活性低于深部肿瘤；iCCA中POSTN⁺ FAP⁺ CAFs、内皮细胞和SPP1⁺ TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）附近的恶性细胞表现增殖和间质特征，包括MKI67、TOP2A和间质相关基因升高。POSTN⁺ FAP⁺基质CAFs富集于侵袭或前缘区域，CD146⁺血管CAFs与肿瘤核心和微血管区域相关并经IL-6/IL-6R信号与肿瘤细胞互作；ARID1A通过抑制AMPK依赖自噬和溶酶体降解稳定NICD1，维持Notch信号并增加TLL1表达，肿瘤来源TLL1激活肝星状细胞，TLL1缺失减少CAF积累、胶原沉积和肿瘤进展。髓系重塑与CAF积累并行：巨噬细胞状态轨迹由FOLR2⁺ TAMs向SPP1⁺ TAMs及MKI67⁺增殖状态推断，伴吞噬程序下调和脂肪酸代谢、缺氧及糖酵解签名上调；CD8⁺ MAIT（黏膜相关恒定T细胞）可能经CCL5–CCR1和CSF1–CSF1R参与巨噬细胞招募，其抗肿瘤程序沿正常肝、侵袭前沿、肿瘤核心递减；POSTN⁺ FAP⁺ CAFs、SPP1⁺ TAMs和内皮细胞在前缘形成空间网络，FAP⁺ CAFs和TAMs可在ECM（细胞外基质）丰富区域积累并与免疫排斥相关，SPP1⁺ TAMs与FAP⁺ CAFs耦合在iCCA中明显。IL-6/STAT3信号是反复出现的炎症轴，血管和炎症CAFs来源IL-6可促肿瘤细胞干性，肿瘤外泌体miR-9-5p增强CAF IL-6产生；KRAS突变iCCA中IL-6/STAT3促进免疫抑制性中性粒细胞编程，炎症CAF IL-6与MDSCs和Tregs积累相关。侵袭前沿因此是肿瘤、基质和免疫重塑协调且细胞毒性淋巴细胞进入和功能受限的生态位。
3.3 缺氧相关髓系生态位：代谢重塑和免疫极化：缺氧影响iCCA多个细胞区室。APOE⁺ TAMs为缺氧响应性巨噬细胞亚群，缺氧激活HIF1A–PPARγ–CD36轴，增加PPARγ依赖FAO（脂肪酸氧化），促脂质氧化和免疫调节状态；CCL3–CCR5被提名为APOE⁺ TAMs与Tregs候选互作，ST和多重免疫荧光支持其在恶性病变内空间邻近；同一数据集中CXCL13⁺前体耗竭CD8⁺ T细胞高表达ENTPD1和ITGAE，较终末耗竭CD8⁺ T细胞具更强细胞毒和增殖能力，丰度与生存改善相关。肝内转移中ANGPTL4⁺ TAMs和缺氧响应恶性上皮细胞富集；缺氧增加巨噬细胞CEBPB表达并直接激活ANGPTL4转录，巨噬来源ANGPTL4结合iCCA细胞整合素α5β1，激活FAK/Src/GSK3β/β-catenin级联，促β-catenin核转位和EMT；功能实验和鼠转移模型显示ANGPTL4增强迁移、侵袭和肝转移，阻断减弱这些表型，血清和组织ANGPTL4升高与肿瘤负荷和肝内转移相关。APOE⁺ TAMs主要与代谢极化和Treg富集相关，ANGPTL4⁺ TAMs在肝内转移中直接支持肿瘤侵袭，说明缺氧是反复选择压力但结果取决于肿瘤区室、巨噬状态和邻近恶性程序。
3.4 原发和转移区室中髓系与肿瘤细胞的免疫抑制生态位：原发瘤中MARCO⁺ TAMs与CTSE⁺肿瘤细胞空间共定位，与转移行为、局部免疫活性降低和不良预后相关，mIHC（多重免疫组化）确认邻近，细胞通讯分析提示LGALS9–CD44等galectin信号。巨噬细胞还通过互作促肿瘤细胞可塑性：去分化恶性细胞KRT18和TM4SF4下调，增殖细胞MKI67和TOP2A表达；NicheNet提示SPP1⁺ TAMs来源TGFB1和 resident macrophage来源CXCL12与恶性状态转变相关，空间和功能观察支持TGFB1–YAP1轴，YAP1⁺恶性细胞邻近TGFB1⁺ CD68⁺巨噬细胞，巨噬耗竭减少小鼠YAP1⁺去分化恶性细胞；巨噬来源HMGB2被提名为促增殖信号，肿瘤细胞IL-18与巨噬细胞LILRB1/LILRB2诱导相关。肝转移中COL3A1⁺上皮亚群具混合EMT特征和增强侵袭能力；侵袭相关状态与内皮重塑相关，JAG1–NOTCH3为候选内皮互作，功能实验显示COL3A1⁺上皮细胞促内皮–间质转化和肿瘤侵袭；定植相关状态招募VEGFA⁺ CCL4⁺中性粒细胞，后者产生NETs（中性粒细胞胞外诱捕网），可能降低细胞毒免疫监视并支持转移建立。淋巴结转移中SAA1⁺肿瘤细胞和CD36⁺脂代谢TAMs参与转移生态位组织，SAA1–CD36轴被提名且mIHC显示空间邻近；抑制SAA1或CD36减少迁移侵袭并降低N-cadherin、Vimentin和SMAD3表达；CD36⁺ TAMs与耗竭CD8⁺ T细胞和Tregs空间相关，THBS1⁺ myCAFs（肌成纤维细胞性CAFs）富集并与基质重塑和巨噬招募相关。
3.5 iCCA免疫生态系统的整合空间模型：空间研究提示iCCA免疫微环境由相互作用的组织模块组成，包括TLS富集适应性免疫区域、侵袭前沿基质–髓系界面、缺氧相关生态位及原发或转移髓系–肿瘤生态系统。跨研究支持最强的是TLS组织和基质–髓系重塑的总体模式，部分位点特异细胞程序仍描述于较窄生物学背景。免疫和基质状态具情境依赖：SPP1⁺ TAMs参与侵袭前沿重塑，APOE⁺ TAMs与缺氧相关免疫调节程序相关，CD36⁺巨噬细胞表征转移淋巴结环境；轨迹分析提示部分巨噬状态转变，但现有证据不支持将所有巨噬群体置于单一分化连续体。CAF程序同样依赖空间背景，POSTN⁺ FAP⁺ CAFs偏好侵袭前沿，CD146⁺血管CAFs富集于肿瘤核心和微血管区。T细胞状态亦呈空间结构，效应、前体耗竭、终末耗竭和MAIT程序占据不同免疫生态位。恶性、免疫、基质和血管区室互作产生同一肿瘤内空间异质性免疫状态，解释单通路靶向可能不足；空间组织已开始指导治疗反应分层，PLAUR相关免疫签名结合单细胞、空间和放射基因组分析形成与免疫化疗反应相关的放射转录组签名，并为uPAR（尿激酶纤溶酶原激活物受体）导向干预提供临床前支持。现有数据多为横断面，空间图谱应视为情境依赖组织的快照而非时间演化重建。
4 iCCA代谢重编程与免疫–代谢串扰：代谢状态动态，受营养、缺氧、炎症、致癌通路、病原相关刺激及基质/免疫细胞互作影响；iCCA代谢重塑涉及肿瘤间代谢状态与免疫背景、肿瘤细胞内在代谢依赖、肿瘤来源代谢产物重塑巨噬和T细胞功能以及病因特异机制。
4.1 肿瘤间代谢状态塑造免疫背景：多组学将iCCA分为代谢不同亚型。S1亚型FAO和脂肪酸降解较活跃，免疫较活跃，效应记忆CD8⁺ T细胞、DCs（树突状细胞）和Tregs浸润增加，生存较好。S2亚型糖酵解主导，HK1和PFKM等糖酵解酶升高、脂肪酸降解降低，伴CD39/CD73相关腺苷信号增加、效应记忆CD8⁺ T细胞浸润减少和naive-like CD8⁺ T细胞富集，呈免疫抑制背景。S3亚型代谢相关蛋白总体较低，无特定通路主导富集，呈免疫荒漠样表型，免疫浸润有限，临床结局中等。S1–S3框架说明代谢状态与免疫架构相关，宜用于按代谢状态和免疫背景分层，而非单独解释免疫激活或排斥。
4.2 肿瘤细胞内在代谢依赖：MAL2为脂代谢调节因子，稳定细胞膜EGFR并激活EGFR/SREBP-1信号，增加FASN、SCD和ACLY等脂生成酶表达；MAL2过表达或敲低改变iCCA细胞对顺铂敏感性，异种移植中MAL2高肿瘤脂质积累更多、生长更快。SIRT6为NAD⁺依赖去乙酰化酶，SIRT6–GLUL轴增强GLUL转录和蛋白稳定性，提高细胞内谷氨酰胺并维持核苷酸和氨基酸池；抑制SIRT6或GLUL可抑瘤并增强吉西他滨–顺铂疗效。MAL2介导脂生成和SIRT6–GLUL介导谷氨酰胺合成代表不同内在代谢适应。
4.3 肿瘤来源代谢信号介导免疫–代谢串扰：USP1相关lipophagy–lipogenesis程序增加肿瘤细胞长链不饱和脂肪酸释放，TAMs以FABP5依赖方式摄取，导致脂滴积累、氧化代谢增强、ROS产生和免疫调节性巨噬状态；FABP5敲低减少脂肪酸摄取和脂质介导巨噬极化，油酸补充或FABP5过表达可在USP1缺失后恢复表型；肿瘤细胞USP1缺失减少FABP5⁺ TAMs并改变巨噬功能状态。条件培养基和共培养显示该脂质程序塑造的TAMs抑制活化CD8⁺ T细胞增殖和IFN-γ产生；CCL4和MHC-I相关互作被计算提名但未独立验证为因果介质，功能实验支持巨噬到T细胞的总体效应而非特定信号路线。
4.4 病因特异代谢重塑：华支睾吸虫–FASN轴：在华支睾吸虫（C. sinensis）相关iCCA中，排泄分泌产物上调E2F1、增加FASN表达、增强脂肪酸合成并促恶性进展；FASN介导的脂肪酸生物合成重塑免疫环境，FASN活性和游离脂肪酸产生增加与TAM富集、T细胞功能受损及肿瘤细胞与巨噬细胞更紧密组织相关；FASN抑制减少免疫抑制特征并增强抗PD-1疗效。该C. sinensis–FASN–脂质程序连接肿瘤内在代谢激活和免疫重塑，但证据限于C. sinensis相关队列和模型，尚不能推广至非C. sinensis相关iCCA。
4.5 iCCA整合代谢–免疫模型：肿瘤间代谢亚型定义从免疫活跃到免疫抑制或免疫荒漠样的背景；MAL2驱动脂生成和SIRT6–GLUL介导谷氨酰胺合成支持生长、代谢适应和治疗抵抗；USP1–FABP5脂质回路连接肿瘤脂质释放、巨噬重塑和CD8⁺ T细胞功能受损；C. sinensis–FASN轴提供病因特异示例。上述机制功能上汇聚于肿瘤适应和免疫生态系统重塑，但源于不同生物学背景，并非iCCA通用通路。代谢与空间免疫生态交叉，缺氧、基质组织和炎症信号塑造代谢状态，肿瘤代谢产物可重编程巨噬和改变细胞毒性淋巴细胞活性；未来结合空间代谢组、单细胞 profiling、同位素示踪和功能扰动可定义特定生态位内代谢程序演化及其与免疫状态互作。
5 将单细胞和空间生态系统见解转化为iCCA免疫治疗策略：转化需证据逐级积累，包括空间确认、功能测试、临床前评估、检测开发和独立临床验证；scRNA-seq和ST在连接细胞状态、空间生态位和互作程序与可重复机制及临床可测特征时最有信息价值。
5.1 空间信息候选免疫治疗靶点：SPP1、MARCO和PLAUR/uPAR代表三条互补路径：破坏侵袭前沿免疫屏障、重编程巨噬中心抑制生态位、整合治疗反应分层与机制导向靶向；证据成熟度不同。
5.1.1 SPP1与侵袭前沿免疫排斥：SPP1为分泌配体，SPP1⁺ TAMs为高表达SPP1的巨噬状态；iCCA侵袭前沿SPP1⁺ TAMs富集于含POSTN⁺ FAP⁺ CAFs和内皮细胞的前缘区域，与细胞毒免疫活性降低相关。HCC临床前研究显示SPP1阻断或巨噬来源Spp1缺失破坏SPP1⁺巨噬–CAF屏障，增加细胞毒性T细胞浸润并增强抗PD-1疗效；巨噬来源SPP1亦经SPP1–CD44损害CD8⁺ T细胞功能。iCCA中直接功能证据仍有限，直接抑制SPP1信号与重编程SPP1⁺ TAMs应视为相关但不同策略。
5.1.2 MARCO与巨噬中心抑制生态位：空间 profiling 识别MARCO⁺ TAMs与CTSE⁺肿瘤细胞共定位，定义与局部免疫活性降低、转移行为和不良预后相关的巨噬富集区域；计算推断的LGALS9–CD44轴提示MARCO⁺ TAMs参与肿瘤–髓系生态位。功能证据显示遗传或抗体干扰MARCO可减少iCCA小鼠肿瘤生长，使MARCO证据从空间和预后关联推进至临床前功能扰动；MARCO靶向能否增强检查点阻断尚待临床评估。
5.1.3 PLAUR–uPAR连接反应分层与临床前靶点验证：PLAUR与CD40LG、FGFR4组成三基因免疫相关评分，整合单细胞、空间和放射基因组分析形成与免疫化疗反应相关的放射转录组签名，并与肿瘤区域PLAUR表达和巨噬浸润相关；前瞻性验证仍需开展。遗传和抗体干扰uPAR减少iCCA细胞增殖和迁移并影响巨噬招募，抗uPAR治疗减少uPAR阳性PDX（患者来源异种移植）人源化小鼠肿瘤生长，联合PD-1阻断进一步增强抗肿瘤活性。总体上，SPP1在iCCA中仍主要为假设生成，MARCO具较强iCCA特异临床前支持，PLAUR/uPAR目前提供最整合的生物标志物到干预框架但仍需独立和前瞻性验证。
5.2 通过生态系统层面见解优化免疫治疗方案：iCCA免疫治疗从检查点单药转向克服髓系抑制、基质排斥、异常血管和肿瘤细胞适应等多项生态屏障的联合策略；TOPAZ-1和KEYNOTE-966确立化疗联合PD-1/PD-L1阻断为晚期BTC（胆道癌）包括iCCA的III期支持一线平台，GOLP、CASTLE、溶瘤病毒、代谢–免疫联合和强化检查点策略仍处于不同程度研究阶段。scRNA-seq和ST更适合定义反应相关细胞状态和耐药机制，而非在单一疗效尺度上排序不同方案。
5.2.1 从III期化疗免疫标准到剂量优化免疫重塑：TOPAZ-1中durvalumab联合GemCis改善总生存和无进展生存，客观缓解率增至26.7%而单纯化疗为18.7%，3–4级不良事件未大幅增加；KEYNOTE-966独立显示pembrolizumab联合GemCis在总体BTC及预设iCCA亚组总生存获益一致，但两组客观缓解率约29%。生存获益与客观缓解分离提示检查点阻断效应不完全由初始肿瘤缩小解释。低剂量GemCis联合PD-1/PD-L1阻断在iCCA小鼠中保持抗肿瘤活性，减少免疫抑制性SPP1⁺ TAMs，重编程TAMs内STAT1/STAT3信号，降低SPP1表达并减弱SPP1–VLA-4对CD8⁺ T细胞的抑制；初步临床观察仍属探索性。该研究将化疗重新定义为剂量可影响肿瘤生态系统的免疫调节组分，SPP1⁺ TAMs与效应CD8⁺ T细胞平衡可作为未来试验相关性终点。
5.2.2 GOLP：整合化疗、抗血管生成和PD-1阻断：GOLP联合吉西他滨–奥沙利铂、lenvatinib和PD-1阻断，同时靶向肿瘤增殖、血管信号和免疫抑制。单中心II期30例晚期iCCA中toripalimab联合lenvatinib和GEMOX客观缓解率80%，中位无进展生存和总生存分别为10.2和22.5个月，≥3级不良事件56.7%；随机II–III期neoGOLP评估可切除高危iCCA新辅助GOLP，中位无事件生存18.0个月对手术优先8.7个月，提供更强随机证据，晚期 regimen 的III期证据仍待。伴随单细胞研究显示基线增殖CD8⁺ T细胞和GZMB⁺ CD8⁺效应细胞比例较高与较好反应相关，基线CD5L⁺ TAMs较低亦与较好反应相关；纵向分析提示有利反应涉及从增殖和GZMB⁺ CD8⁺状态向GZMK⁺状态转变，差反应者状态转变不完全且T细胞功能障碍更明显，CD5L⁺ TAMs通过促效应T细胞抑制程序参与耐药，抗CTLA-4可在小鼠iCCA中逆转耐药。IMbrave151中bevacizumab联合atezolizumab和GemCis未改善iCCA亚组无进展或总生存，提示抗血管–免疫化疗协同具情境依赖。
5.2.3 CASTLE：局部消融作为系统性免疫重塑启动器：CASTLE-01单臂II期28例化疗后晚期或转移iCCA接受冷冻消融后sintilimab和lenvatinib，客观缓解率75%、疾病控制率100%，中位无进展生存和总生存16.8和25.4个月；小样本无随机对照限制直接比较。配对治疗前后多组学支持序贯重塑模型：冷冻消融增加肿瘤免疫原性和DCs活化，lenvatinib改变血管和基质状态以促淋巴细胞浸润，PD-1阻断帮助维持瘤内效应T细胞活性；基线“热”与“冷”转录表型未清晰区分反应者，治疗中免疫细胞组成和空间组织变化更具信息。相关随机II期比较冷冻消融、lenvatinib和PD-1阻断与FOLFOX化疗正在进行。
5.2.4 新兴生态指导的扰动策略：VG161多组学分析伴初步临床活性显示增强抗原提呈、CD8⁺ T细胞活化和巨噬重塑；C. sinensis相关iCCA模型中抑制FASN介导脂肪酸合成减少巨噬相关免疫抑制并增强抗PD-1活性。这些策略较III期化疗免疫或已临床评估多维方案更早期，主要价值在于展示生态 profiling 可提名不同生物约束，包括弱免疫启动和脂质依赖免疫抑制，并可实验性扰动。
6 讨论：整合scRNA-seq和ST支持空间生态系统模型：TLS相关适应性区域、侵袭前沿基质–髓系界面、缺氧相关生态位和转移生态系统组织不同免疫状态；巨噬和成纤维细胞程序随解剖背景变化，肿瘤代谢重塑免疫组成和功能，支持相互生态系统重塑而非单一主导通路。多数数据为横断面，所识别生态位应解释为情境依赖状态而非共同时间轨迹的固定阶段。III期试验确立GemCis联合PD-1/PD-L1阻断为晚期BTC包括iCCA一线平台，反应相关签名、候选靶点和联合策略仍处较早转化阶段，其价值在于识别干预可能具生物学相关性的肿瘤–免疫和基质状态。主要未解问题是哪些生态系统特征为iCCA可重复属性、哪些依赖生物学背景；许多单细胞和空间研究基于较小且常为单中心队列，不能完全代表iCCA组织学、分子、病因、解剖和治疗相关异质性。病因可贡献变异，如C. sinensis相关iCCA中寄生虫信号和FASN依赖脂质重塑与不同代谢和免疫表型相关；解剖部位同样重要，肝内和淋巴结转移含不同肿瘤–免疫–基质程序。部分特征尤TLS相关免疫组织获独立iCCA队列支持，而许多髓系、转移和代谢程序仍主要基于单队列或情境汇聚证据；可重复性应在保守生物程序和空间关系层面判断。方法学稳健性依赖聚类策略、参考选择、注释框架和独立队列支持程度；单细胞与空间数据整合因转录组覆盖、空间分辨率、分割、参考组成和计算策略而具模型依赖；跨研究一致性在转录程序、解剖定位、邻近细胞群体和相关功能层面更具信息。配体–受体兼容性和空间邻近可识别合理互作，但解释依赖分析框架假设；正交成像和空间蛋白组可增强组织定位和蛋白水平证据，扰动实验提供更强功能支持，计算推断、空间关联和功能验证应视为互补但不等价证据层级。最终挑战是确定哪些可重复生态系统特征可转化为临床可测生物标志物：B细胞状态与化疗免疫治疗结局相关，ANGPTL4与转移疾病组织和循环测量相关，多模态放射基因组分析识别PLAUR相关签名与免疫化疗反应相关；需区分预后关联、治疗相关相关性与前瞻性验证的预测生物标志物。前瞻性多中心和纵向研究可确定哪些生态系统特征跨患者和解剖区室稳定、治疗中变化并对反应或耐药有信息价值；空间组学和非侵入生态系统 profiling 可能将复杂组织状态转化为更可扩展临床读数。总体而言，scRNA-seq和ST已建立将iCCA视为空间组织和代谢调控肿瘤生态系统的框架，下一步更重要的是识别哪些生态系统特征跨生物背景可重复、哪些反映情境依赖适应、哪些具功能证据以及哪些可稳健测量以指导治疗分层。