基于蛋白质相互作用网络与单细胞转录组解析人脑高进化速率表达基因的跨物种及人群内遗传多样性

《Frontiers in Neuroscience》：Network-based analysis reveals genetic diversity of human-brain expressed genes with high evolutionary rates

摘要
引言：比较人类与非人灵长类脑的基因表达谱，可为理解物种间结构和功能差异以及多种疾病起源提供重要线索。近年来，人脑基因组与转录组数据的可获得性，使在分子水平大规模探索脑表达基因的进化特征成为可能。分析人类与非人灵长类脑细胞类型特异性表达且进化速率升高的基因，有助于揭示人脑内在的遗传与功能多样性。
方法：本研究尝试通过分析人类与猕猴脑以及人类谱系中具有差异进化速率的基因，探索人脑的遗传多样性。
结果：研究人员识别出人类与猕猴之间450个高进化速率基因，以及人类人群之间534个高进化速率基因。拓扑特征显示，这些基因在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中具有较低的节点度。研究人员还发现，与神经疾病、免疫、代谢和信号转导相关的通路在人类与猕猴之间高进化速率基因中富集。进一步识别出97个和137个在种间和种内具有差异进化特征的潜在基因。
讨论：研究结果揭示了人脑进化可变特异性表达基因的遗传多样性，并为在转录水平理解人脑进化提供了补充性发现。

人脑具有较大的体积、复杂的组织结构和高级认知能力，是长期进化的产物。比较人类与非人灵长类脑的表达谱，有助于理解物种间结构与功能差异及多种疾病起源。已有研究揭示了人脑相对非人灵长类的特异表达模式、脑区与细胞类型特异性表达特征以及调控进化线索，但人脑结构极其复杂，当前对脑进化基因的功能特征、遗传多样性及基于PPI（protein-protein interaction，蛋白质-蛋白质相互作用）网络挖掘潜在进化基因的认识仍有限。既往通路水平选择压力分析汇总通路内全部基因，难以区分进化信号来自通路整体还是少数进化异常基因。因此，研究人员开展基于网络的系统分析，比较人脑与猕猴及人群内基因进化速率，识别高进化速率基因，分析其PPI网络拓扑特征、功能富集和潜在进化基因，并进行单细胞转录组验证。研究识别出450个种间差异进化约束基因（DEinter）和534个种内差异进化约束基因（DEintra），发现其PPI节点度较低，功能涉及神经疾病、免疫、代谢和信号转导，并识别出97个和137个潜在基因。该研究揭示人脑特异性表达基因的遗传多样性，为转录水平理解人脑进化提供补充见解。

关键技术方法：研究整合已发表人脑与猕猴脑转录组表达数据；基于同源基因计算dN/dS（非同义替换率/同义替换率），基于1000 Genomes Project（2,504名个体、26个群体、84.4百万变异）计算pN/pS（群体内非同义/同义多态性比值）；以1.5×IQR（interquartile range，四分位距）识别高进化速率离群基因；用DAVID进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）和GO（Gene Ontology，基因本体）富集；整合BioGRID、IntAct、DIP、MINT、MIPS/MPact、HPRD及Negatome构建PPI网络，并用Steiner最小树算法和1,000次Erd?s–Rényi模拟构建及检验子网络；单细胞验证整合GEO（Gene Expression Omnibus，基因表达综合数据库）数据集GSE293664、GSE302350、GSE319557和GSE183052（131,759个细胞），采用Seurat、Harmony、UMAP（uniform manifold approximation and projection，统一流形近似与投影）、GSVA（gene set variation analysis，基因集变异分析）和clusterProfiler分析。

脑内高进化约束基因的网络属性：研究人员在13,522个兼具dN/dS和pN/pS且在人脑与猕猴脑表达的基因中，以dN/dS和pN/pS离群值识别DEinter和DEintra基因，并将其映射至PPI网络。结果显示，450个DEinter中323个可映射，节点度中位数为5；534个DEintra中415个可映射，节点度中位数为6；13,522个背景脑表达基因中11,712个可映射，节点度中位数为10。DEinter和DEintra基因均表现为较低节点度，提示其多处于PPI网络外周，受较弱纯化选择，更易发生遗传分化。原文举例DEFB、RHCE、APOC2、PTPRC、CD52、PYHIN1、AYM2、GYPA、BTLA、PECR、CD3E和GZMB等基因，其中DEFB和GYPA在种间及人群内均显示遗传多样性。相关性分析还显示，种间dN/dS和种内pN/pS均与细胞类型特异性评分负相关；DEinter和DEintra的细胞类型特异性评分相对背景基因集有显著差异，但两组间无显著差异；CDS长度和GC含量与dN/dS、pN/pS呈显著弱负相关，dS饱和基因通常进化速率较低。

脑内高进化约束基因的功能富集：研究人员用DAVID对DEinter和DEintra进行功能富集，保留KEGG中FDR < 0.2的结果并补充GO BP。DEinter基因显著富集13条通路，主要涉及信号转导、神经退行性疾病和免疫功能，包括AD（Alzheimer’s disease，阿尔茨海默病）、PD（Parkinson’s disease，帕金森病）、HD（Huntington’s disease，亨廷顿病）、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞黏附分子、氧化磷酸化、非酒精性脂肪性肝病以及多条免疫和感染相关通路；GO中还富集味觉和嗅觉刺激相关条目。DEintra基因未检出显著富集KEGG通路，但富集免疫反应、细胞过程、能量代谢和遗传信息过程等GO BP条目，并包括“对听觉刺激的反应”，未出现味觉和嗅觉感觉条目。原文指出这些显著富集通路在人脑中上调或下调尚不明确。

高进化约束基因的特异性子网络：研究人员基于Steiner最小树算法构建DEinter和DEintra子网络。DEinter子网络含397个节点和883条边，其中300个为DEinter基因，占75.6%；DEintra子网络含534个节点和1,136条边，其中397个为DEintra基因，占74.3%。两个子网络分别有97个和137个连接基因（linker genes）位于原基因集之外，这些连接基因各与两个或以上原集合基因相互作用，可能作为信号传递和功能调控的桥梁。置换检验显示真实子网络的全局聚类系数显著高于模拟网络、平均最短路径显著更短（P<0.001），符合BA无标度网络模型；顶点和边介数中心性网络与真实网络的重叠率均高于98.8%。原文列举SRC、EP300、CCR5、EEF1D、CFTR、RAD51、GFAP、MMP9、IL4和COPS5等潜在基因，并指出97个和137个连接基因中有23个共享基因，包括APP、BAG3、CANX、CARD8、COPS5、COPS6、CREB3、DYNLL2、ELAVL1、EWSR1、GRB2、HSP90AB1、KRTAP10-3、LATS2、NRF1、PPP1CC、PRKACA、SIAH1、SUMO1、SUMO2、TERF1、TFAP2C和TFF1。拓扑分析显示，DEinter来源的连接基因节点度与其他DEinter基因相比有统计学显著差异（Vuong test P = 0.0174），连接基因节点度更高；DEintra来源的连接基因无显著差异。

DEinter基因差异表达及通路的单细胞验证：研究人员整合人脑类器官单细胞数据集GSE293664、GSE302350与猕猴脑单细胞数据集GSE319557、GSE183052，获得含131,759个细胞的单细胞数据集。ssGSEA（single-sample gene set enrichment analysis，单样本基因集富集分析）评分显示DEinter特征水平在物种间差异极显著（Wilcoxon rank-sum test，P-value < 2.22e-16），人类组显著更高，该高表达主要由兴奋性神经元和非神经元细胞驱动。KEGG分析显示，DEinter的13条显著富集通路中有8条在单细胞数据集中重复；细胞黏附分子和AD通路在人脑中显著下调，分别受非神经元细胞和兴奋性神经元影响，提示人类与非人灵长类在细胞黏附信号和神经退行性疾病通路方面存在进化差异。

讨论部分总结：研究指出人脑与猕猴脑存在结构差异，人脑群体间也存在皮层厚度、灰质体积和皮层表面积差异；本研究从编码序列和网络分析角度补充了转录水平的人脑进化认识。与既往汇总通路水平分析相比，本研究从高进化速率离群基因切入，表明神经疾病、免疫和代谢相关通路的进化信号主要由通路内少数极端dN/dS和pN/pS离群基因驱动；这些离群基因多位于PPI网络外周并受较弱纯化选择，研究还识别出一组被低估的连接基因。研究控制了CDS长度、GC含量和dS饱和等协变量影响，并利用跨物种单细胞转录组将整体水平通路差异映射至特定脑细胞亚群。原文同时指出局限：人群数据为合并分析，未按亚群分别计算pN/pS；同义变异极少的基因pN/pS估计可能有噪声；分析限于细胞簇特异性评分非零基因；缺乏匹配的人-猕猴多组织数据，不能排除外周组织选择干扰；单细胞分析中脑类器官与成年在体脑组织存在转录组差异，结果应视为探索性观察。

研究结论翻译：综上所述，通过从种间和种内视角系统探索人脑中具有进化速率的基因，本研究揭示了人脑特异性表达基因的遗传多样性，并为在转录水平理解人脑进化提供了补充性见解。