面向药物合成与代谢物制备的过加氧酶工程化改造：选择性氧化、催化性能提升与工业适用性展望

《Chemical Science》：Engineering peroxygenases for pharmaceutical applications: recent advances and future perspectivesOpen Access

　　

选择性氧化是药物生物合成的基石性过程，因为它能够将惰性C–H键转化为醇、酮、环氧化物和羧酸等高价值官能团，这些官能团是药物合成中的重要中间体。过加氧酶（peroxygenases），包括非特异性过加氧酶（unspecific peroxygenases, UPOs）和P450过加氧酶（P450 peroxygenases），已成为酶促氧化的强大生物催化剂，在代谢物合成、后期C–H官能团化以及药物开发中对映体富集中间体的制备等方面应用日益增长。在本综述中，研究人员介绍过加氧酶工程化改造用于制药应用的最新进展。研究人员总结可作为过加氧酶底物的候选药物，讨论过加氧酶介导的这些底物的酶促氧化途径，并概述用于提高过加氧酶在药物生物合成中催化性能与性质的蛋白质工程策略。研究人员还讨论新兴人工智能（artificial intelligence, AI）策略在多维过加氧酶工程化改造中的潜力，涵盖催化活性、热稳定性、H₂O₂耐受性、异源表达（heterologous expression）、底物谱（substrate scope）、区域选择性（regioselectivity）和对映选择性（enantioselectivity）。总体而言，过加氧酶工程化改造的持续进展将推动这些生物催化剂转化用于多种工业应用，从而实现可持续药物合成、高效代谢物生产和创新治疗策略。

1 引言
制药工业对可持续、高效、选择性生物催化需求增加。血红素-硫醇盐加氧酶包括依赖O₂/NAD(P)H的细胞色素P450单加氧酶和依赖H₂O₂的非特异性过加氧酶（UPO）。过加氧酶在药物代谢物合成和药物相关化合物合成中应用扩展；蛋白质工程用于改善表达、底物特异性和催化效率，工业转化还需考虑酶产量、催化剂寿命、时空产率（STY）、体积生产力和过程经济性。

1.1 通过（选择性）氧化进行药物生物合成
选择性氧化将惰性C–H键转化为醇、酮、环氧化物和羧酸等，是活性药物成分（API）合成和后期官能团化的关键。传统化学氧化条件苛刻、区域/立体选择性差且环境负担大；细胞色素P450单加氧酶（CYPs）、氯过氧化物酶（CPOs）和过加氧酶可在温和条件下高选择性氧官能团化。过加氧酶以H₂O₂为单一氧化剂，无需辅助氧化还原伙伴和昂贵辅因子，可催化羟基化、环氧化和磺氧化；理性设计、定向进化、KnowVolution及机器学习/生成式AI可提升稳健性。

1.2 作为过加氧酶底物的候选药物概述
过加氧酶底物谱近十年显著扩展，区域选择性常优于化学氧化。β-阻滞剂普萘洛尔经工程UPO催化5′-羟基化；非甾体抗炎药（NSAIDs）双氯芬酸、萘普生、布洛芬和乙酰苯胺衍生物经芳香羟基化/氧化脱烷基化生成人相关代谢物；右美沙芬、甲苯磺丁脲、西地那非和奥司他韦等可被区域选择性氧化。阿托伐他汀经工程CYP102A1变体羟基化；睾酮和钙化醇等发生区域/立体选择性氧化；候选药物SAR548304经Marasmius rotula UPO选择性N-脱烷基化。底物涵盖β-阻滞剂、NSAIDs、抗病毒药、中枢神经系统药、他汀、甾体激素和新兴候选药物，反映活性位点可塑性和血红素-硫醇盐中心控制的自由基化学。

2 当前酶促氧化途径
2.1 P450过加氧酶
细胞色素P450（CYPs）是最大、最多样的酶超家族之一，经典P450利用O₂和NAD(P)H来源电子催化羟基化、环氧化、脱烷基化和磺氧化。CYP152家族等P450可通过“过氧化物穿梭”（peroxide shunt）途径利用H₂O₂生成compound I，无需NAD(P)H、O₂和氧化还原伙伴，称为P450过加氧酶；其与经典P450在机制、辅因子需求和实用性上不同。天然P450过加氧酶主要催化脂肪酸α-/β-羟基化，部分进行氧化脱羧；P450单加氧酶也可经工程改造为过加氧酶。

2.2 非特异性过加氧酶
UPO（EC 1.11.2.1）为血红素-硫醇盐酶，不依赖辅因子进行选择性氧官能团化，仅需H₂O₂作为电子受体和氧源，兼具过氧化物酶和过加氧酶催化特征。AaeUPO自2004年发现后成为研究最广的UPO。UPO分短UPO和长UPO：短UPO如MroUPO、CglUPO为同二聚体，活性位点His稳定电荷，通道较宽，偏好甾体等大底物；长UPO如AaeUPO、PabUPO为单体，活性位点Arg稳定电荷，通道刚性芳香族氨基酸，偏好小芳香底物；保守基序分别为–EHD–S–E–和–EGD–S–R–E–。其双催化循环中，H₂O₂经保守Glu去质子化形成compound 0并重排为compound I（+˙heme-Fe⁴⁺O═），过加氧酶路径抽取底物R–H的H⁺和e^?形成compound II（heme-Fe⁴⁺–OH）和底物自由基R˙，结合生成羟基化产物；可催化C–H羟基化、C═C环氧化、N-氧化、溴化、磺氧化和酚类单电子氧化。

3 提高过加氧酶性能的蛋白质工程策略
天然过加氧酶受异源表达低、H₂O₂失活、底物依赖性选择性、操作稳定性不足及突变影响难预测等限制。真菌UPO异源表达涉及信号肽识别与切割、糖基化、宿主折叠、血红素掺入和翻译后加工；H₂O₂过量经compound III和羟自由基导致血红素降解和漂白。选择性受远端活性位点和通道残基控制，工程改造存在活性、稳定性、过氧化物反应性和折叠间权衡；定向进化、理性设计和AI指导为三类策略。

3.1 定向进化
3.1.1 P450过加氧酶
定向进化可提高P450活性和立体/区域选择性。P450BM3经定向进化生成多种药物人代谢物；Pseudomonas putida P450经定向进化获得利用H₂O₂的“过氧化物穿梭”突变体，萘羟基化活性提高20倍。CYP119经定向进化成为苯乙烯环氧化过加氧酶，TOF达308.8 min^?1；CYP199A4、CYP154C8和CYP107通过改造氧结合区转化。P450BM3血红素域（BM3-H）变体可利用H₂O₂羟基化脂肪酸，并将普萘洛尔转化为4′-和5′-羟基普萘洛尔；CYP102A1变体催化阿托伐他汀4-羟基化。P450BSβ经定向进化实现脂肪酸β-羟基化（>99% ee，TTN达1540）及C(sp³)–H对映选择性γ-内酯化（TTN 3278）。

3.1.2 非特异性过加氧酶
UPO用于人药物代谢物（HDMs）合成，但产量和稳健性限制应用，已表征UPO不足推定序列的1%。AaeUPO定向进化得PaDa-I，在S. cerevisiae和P. pastoris中产量分别达8和217 mg L^?1；其他真菌UPO在酵母表达，细菌UPO可在E. coli达mg L^?1。比色高通量筛选（HTS）分为过氧化物酶活性（ABTS、DMP）和过加氧酶活性（NBD、Fast Red）两类。UPO与氧化酶偶联可转化64种药物中的33种；MroUPO将环磷酰胺羟基化为4-羟基环磷酰胺（TTN 10 000），CglUPO氧化睾酮生成4,5-环氧化物和16α-羟基睾酮（TTN 7000）。AaeUPO变体SoLo提高5′-羟基普萘洛尔区域选择性15倍（>99%），与原位H₂O₂生成系统结合TTN达420 000；并用于右美沙芬O-脱烷基化、萘普生脱甲基和甲苯磺丁脲羟基化。AaeUPO变体实现维生素D C-25区域选择性羟基化，活性提高25–27倍，选择性>93%；MthUPO变体将2-甲基萘氧化为维生素K3；4-OT和MthUPO工程变体分别提高环氧化和苄位羟基化性能。

3.2 理性设计
3.2.1 P450过加氧酶
理性设计用于改善天然过氧化物依赖酶并将经典P450单加氧酶转化为H₂O₂驱动过加氧酶。PROSS策略使CYP152过加氧酶POSPα H₂O₂耐受性提高4倍，V3-P04在耐受性、表达和辛酸α-羟基化比活性上优于亲本。转化策略包括氧结合槽工程、双功能小分子（DFSM）辅助催化和H₂O₂通道工程（HTE）。

3.2.1.1 氧结合槽工程
P450 I-helix保守酸-醇对（Asp/Glu–Thr）介导O₂活化质子传递；将Thr替换为Asp/Glu可引入酸碱功能，促进H₂O₂异裂和compound I形成。CYP199A4 T252E增强对位取代苯甲酸过加氧酶活性，催化O-脱甲基化和4-乙烯基苯甲酸对映选择性环氧化（(S)-环氧化物约92% ee）；D251Q/T252E模拟天然Gln–Glu基序。CYP119-perox7室温活性提高>10倍、80 °C提高35倍；CYP154C8 T258E对孕酮和雄烯二酮羟基化活性提高>100倍；CYP107PQ1 E247Q/A248E催化β-紫罗兰酮生成(S)-4-羟基-β-紫罗兰酮（约94% ee）。

3.2.1.2 双功能小分子（DFSM）辅助催化
DFSM由锚定酰氨基氨基酸和远端碱性基团（常为咪唑）组成，可锚定底物通道并提供酸碱基团促进H₂O₂异裂。Im-C6-Phe辅助P450BM3变体在无NAD(P)H和氧化还原伙伴时催化苯乙烯环氧化、硫代苯甲醚磺氧化和乙苯羟基化，TTN分别达2733、4910和730；并用于小烷烃羟基化、吲哚合成靛蓝类染料和芳香伯胺N-氧化。不同DFSM与P450BM3变体组合实现烷基苯区域发散和对映选择性羟基化（区域选择性>99%，ee>99%，TTN达80 963），吡啶基DFSM提高C(sp³)–H羟基化TTN；结合AldO原位产H₂O₂实现木质素衍生芳香醚O-脱甲基化。

3.2.1.3 H₂O₂通道工程
HTE改造连接活性位点与溶剂的天然水通道，利用水与H₂O₂相似性改善过氧化物可及性。CAVER指导的CYP199A4通道突变使4-甲氧基苯甲酸O-脱甲基化提高>183倍，关键门控残基为F182和D251；CYP153AM.aq羟基化改善15倍，CYP105D18变体F184A/F191A/E196A睾酮羟基化效率提高约80倍。HTE与氧结合槽工程结合使CYP154C5变体催化睾酮和诺龙16α-羟基化（转化>98%，TTN约953）；HTE还增强Im-C6-Phe/P450BM3系统，GV/L272S降低H₂O₂需求95–97.5%，偶联效率约95%。

3.2.2 非特异性过加氧酶（UPOs）
UPO理性设计针对低活性、异源表达差、选择性和H₂O₂失活，计算辅助设计可识别热点并构建聚焦文库。CviUPO经HotSpot Wizard、对接、通道分析和MD指导，变体活性提高13倍、C–H氧化ee>99%；FoldX指导获得M1_T9P_G161L，半衰期延长36倍、活性提高6倍并保持>99% ee。祖先序列重建（ASR）结合口袋工程获得N1，表达提高3倍，甾体11β-区域选择性达99%，可克级合成羟基化甾体。MthUPO经MD指导提高β-紫罗兰酮4-羟基化活性17倍、区域选择性99.6%。SBPCS策略使AaeUPO三突变M3的C25-羟基化效率提高5.16倍，25(OH)VD3产量提高至354.40 mg L^?1。FuncLib用于AaeUPO和MthUPO，分别提高TTN和萜类氧化活性/选择性；SoLo与芳醇氧化酶FX9融合构建自给UPO–AAO催化剂，原位产H₂O₂合成右旋吗啡烷TTN 62 000。

3.3 AI指导的过加氧酶工程：新兴机会与未来方向
AI/机器学习（ML）可数据驱动探索序列空间，减少实验负担；流程包括数据预处理、蛋白表示、模型训练验证和变体预测，输入可含序列理化描述符、结构和进化特征、预训练蛋白语言模型（PLMs）嵌入及底物描述符。监督学习需标记序列-功能数据，无监督/自监督利用无标记数据；UPO和P450过加氧酶标准化数据集不足，零样本、少样本、迁移学习和主动学习/贝叶斯优化较为适用。相关酶研究已用PLM、高斯过程、DLKcat、EVOLVEpro、MODIFY等提高P450活性、热稳定性和立体选择性；直接用于过加氧酶的案例仍少，包括CYP152过加氧酶的MD轨迹无监督ML分析、深度学习挖掘细菌UPO-like酶，以及AbrUPO的任务特定LSTM结合超高通量筛选。生成式AI如ProGen/ProGen2、ESM3、ProteinMPNN、LigandMPNN和RFdiffusion系列可用于生成或设计血红素环境和底物通道，但多需实验验证。未来AI更可能作为整合结构模型、序列/进化信息、对接、MD和实验数据的预测框架，优先突变并指导聚焦文库，而非替代传统工程。

4 展望
过加氧酶已从 niche 氧化酶发展为可执行药物相关氧官能团化的适应性催化剂；下一阶段应从展示催化潜力转向在制备和过程相关条件下建立应用特定性能。核心是多维优化而非单一参数，最有用的生物催化剂应在活性、总转化数（TTN）、稳定性、表达和选择性间取得应用特定平衡；代谢物/分析标准合成可偏重高选择性，药物中间体制造更重视催化剂和过程生产力。需建立应用特定基准，将分子改进与单位催化剂分离产物量、产物浓度或制备转化总效率联系，并并行推进蛋白与过程优化。多目标需求需整合定向进化、理性和结构指导设计、计算辅助、酶挖掘和AI/ML；工作流程可从天然支架选择开始，用结构/数据驱动识别高价值区域，实验探索聚焦文库并将数据返回预测设计。AI/ML近期价值在于提高多性质权衡探索效率，需建立连接序列/结构与催化表型及可比实验条件的数据，尤其包含失败/中间变体；主动学习可按预测性能和信息增益优先实验。长期可形成生成模型、自动构建筛选和设计-构建-测试-学习闭环。过加氧酶还可作为多酶级联、受控H₂O₂生成模块和化学酶序列的组分，简化完整合成。领域应从扩展底物谱转向识别过加氧酶具独特合成优势的转化，匹配未满足的位点/化学/立体选择性需求。总体，关键问题是完整催化剂-反应系统能否在所需规模选择性、可重复且经济地执行转化，发展重心正从酶中心优化转向应用中心开发。