《Veterinary Parasitology》：Development and validation of a recombinant chimeric antigen based on
Leishmania infantum B-cell epitopes for canine serology
编辑推荐：
本研究描述了一种新型多表位嵌合蛋白（rChi）的开发与验证，用于由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的犬利什曼病（CanL）的血清学诊断。rChi构建体是基于先前通过免疫蛋白质组学分析鉴定的假定蛋白的B细胞表位工程化设计的。为评估其诊
本研究描述了一种新型多表位嵌合蛋白（rChi）的开发与验证，用于由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的犬利什曼病（CanL）的血清学诊断。rChi构建体是基于先前通过免疫蛋白质组学分析鉴定的假定蛋白的B细胞表位工程化设计的。为评估其诊断性能，研究人员采用间接ELISA，使用了一个包含291份犬血清样本的综合样本组，其中包括临床患病犬、亚临床感染犬和未感染犬，以及Leish-Tec?疫苗接种动物和感染潜在交叉反应病原体（Babesia vogeli、Ehrlichia canis和Trypanosoma cruzi）的动物。与婴儿利什曼原虫可溶性利什曼抗原（SLA）相比，rChi-ELISA表现出更优的诊断参数，实现了92.2%的敏感性和76.2%的特异性（AUC = 0.85；准确度 = 80.8%），而SLA仅显示出50.0%的敏感性和68.3%的准确度。这些研究结果表明，rChi蛋白显著增强了CanL的检测能力，代表了用于更准确的兽医诊断和监测的一种有前景的工具。
基于婴儿利什曼原虫B细胞表位的重组嵌合抗原：犬利什曼病血清学诊断的新策略
一、研究背景与问题提出
内脏利什曼病（Visceral leishmaniasis，VL）是由利什曼属原虫引起的严重全身性疾病，在美洲和地中海盆地主要由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）所致。在拉丁美洲，VL是一种人畜共患病，家犬被确认为主要动物宿主。在流行地区，亚临床感染犬高度流行，占血清阳性群体的重要比例，但其在传播循环中的具体作用仍在研究中。临床上，VL常表现为亚急性或慢性病程，特征为长期发热、进行性体重下降和显著的肝脾肿大，严重时可出现全血细胞减少、恶病质及危及生命的继发感染或出血。
家犬是婴儿利什曼原虫的主要城市宿主，无论临床状态如何，其皮肤中通常携带高寄生虫载量，对媒介白蛉具有高度传染性。在巴西，控制策略包括治疗人类病例、媒介控制以及通过血清学筛查识别感染犬。然而，现有措施效果有限，部分原因在于当前诊断工具在识别亚临床感染携带者方面的局限性。
目前可用的血清学方法包括间接荧光抗体试验（IFAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和直接凝集试验（DAT）。巴西当前的诊断方案采用DPP? CanL快速免疫层析试验进行筛查，随后以可溶性利什曼抗原（SLA）ELISA进行确认。然而，这些检测常无法准确检测亚临床感染犬，且与传统病原体如Babesia vogeli、Ehrlichia canis和Trypanosoma cruzi存在交叉反应。此外，犬用免疫生物制品和疫苗的开发使血清学解读更加复杂。鉴于该感染可能进展为致命结局以及犬在维持寄生虫循环中的关键作用，开发高灵敏度诊断工具至关重要。
二、研究内容与结论
为改进诊断性能，研究人员开发了重组嵌合蛋白策略。与由复杂且标准化程度低的蛋白质混合物组成的SLA不同，嵌合抗原可将多个特异性B细胞表位整合到单一分子中，提高敏感性并减少交叉反应。基于先前通过免疫蛋白质组学方法鉴定的婴儿利什曼原虫假定蛋白面板，本研究合理设计并评估了一种整合五个验证靶标的新型多表位嵌合蛋白（rChi），旨在确定将这些表位融合为单一重组蛋白是否能提供更可靠、标准化的CanL血清学诊断工具。
研究结果显示，rChi蛋白在检测有症状和亚临床感染犬方面均表现出高敏感性（92.2%），显著优于SLA（50.0%）。rChi的特异性为76.2%，SLA为73.5%。rChi的AUC值为0.850，明显高于SLA的0.546。该嵌合蛋白代表了CanL诊断领域的重要进展，为更准确的兽医诊断和监测提供了有前景的工具。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：基于免疫蛋白质组学筛选鉴定五个婴儿利什曼原虫假定蛋白（LINF_350006800、LINF_320035400、LINF_240014200、LINF_040011200和LINF_320039900）；利用ABCpred人工神经网络预测线性B细胞表位（阈值0.85，窗口14/16个氨基酸），并通过IEDB Emini表面可及性预测算法验证；使用BLASTp和Clustal Omega进行序列保守性和交叉反应性分析；将验证的表位线性组装为嵌合蛋白，以两个甘氨酸作为柔性连接子；通过pET-28a-TEV(+)载体在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，采用固定化金属亲和色谱（IMAC）纯化；间接ELISA评估诊断性能。样本队列包括291份犬血清：临床患病犬（ICACanL，n=50）、亚临床感染犬（SICanL，n=14）、流行区健康犬（HDEA，n=75）、非流行区健康犬（HDNEA，n=45）、Leish-Tec?疫苗接种健康犬（HDI，n=75）、Babesia vogeli感染犬（Bv，n=10）、Ehrlichia canis感染犬（Ec，n=10）和Trypanosoma cruzi感染犬（Tc，n=12）。
四、研究结果
3.1 B淋巴细胞表位分析与多表位蛋白制备
基于五个假定蛋白，通过BLASTp局部比对确认了利什曼属内的高序列保守性，同时与锥虫属和细滴虫属蛋白低度或无相似性。ABCpred预测的线性B细胞表位经Clustal Omega多序列比对筛选，选择仅在利什曼属内保守的表位。所有五个选定表位均通过Emini表面可及性评分，表明其暴露于蛋白表面可供抗体识别。由此构建了333 bp的多表位基因，编码133个氨基酸的多肽，预测分子量14.41 kDa，等电点10.79，净正电荷19.4（pH 7.0）。蛋白不稳定指数为35.76，归类为生物稳定。SDS-PAGE和Western Blot验证了rChi蛋白的正确表达和纯度，显示约14.0 kDa的明显条带。
3.2 rChi蛋白用于犬利什曼病血清学诊断的性能
使用完整犬血清面板（n=291）评估rChi蛋白的诊断潜力并与SLA比较。rChi的AUC值为0.850（95% CI: 0.8-0.9），SLA为0.546（95% CI: 0.5-0.6）。rChi的总敏感性为92.2%（95% CI: 82.7-97.4%），总特异性为76.2%（95% CI: 70.1-81.6%），准确度80.8%；SLA的总敏感性仅为50.0%（95% CI: 37.2-62.8%），特异性73.5%（95% CI: 67.2-79.1%），准确度68.3%。
五、讨论与结论
讨论部分指出，CanL的准确血清学诊断对有效流行病学监测至关重要。rChi蛋白的高敏感性得益于其整合了多个免疫优势线性B细胞表位，能够检测有症状和亚临床感染犬。特异性未达到更高水平的原因主要与Leish-Tec?疫苗免疫犬的血清转化有关，这与既往研究一致。研究人员也承认研究存在局限性：与粗制寄生虫提取物（如SLA）比较涉及不完善的参考基准；建议未来研究考虑更广泛的血清学面板，并纳入Neospora caninum和Toxoplasma gondii等相关疾病的交叉反应评估。
结论部分指出，本研究通过生物信息学策略，从先前蛋白质组学研究中筛选的假定蛋白开发了一种嵌合蛋白。与粗制抗原相比，rChi蛋白的使用提高了免疫测定的敏感性和特异性。更重要的是，它们可代表抗原面板中的重要靶标，显著改善CanL的诊断。该研究建议，基于嵌合蛋白的ELISA策略可能有助于开发敏感且高度特异的CanL或其他寄生虫病的血清学诊断方法。
