《Methods in Ecology and Evolution》：Estimating absolute DNA abundance from replicated metabarcoding
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由混合模板DNA扩增与测序衍生的数据集（“宏条形码”，metabarcoding）在环境DNA（environmental DNA, eDNA）、微生物组或微生物生态学分析中十分常见。此类宏条形码数据已被广泛用于估算多种物种和栖息地的生物多样性、分布和丰度。通
由混合模板DNA扩增与测序衍生的数据集（“宏条形码”，metabarcoding）在环境DNA（environmental DNA, eDNA）、微生物组或微生物生态学分析中十分常见。此类宏条形码数据已被广泛用于估算多种物种和栖息地的生物多样性、分布和丰度。通常，宏条形码数据由一组分类单元或序列变体对应的reads计数表组成。因此，它们看似包含关于所研究环境的定量信息，可立即用于传统群落生态学分析。
事实上，宏条形码数据具有组成性（compositional），可能因各分类单元间PCR扩增效率的差异而产生偏倚，并且具有许多不同于其他常见生态观测数据的统计属性。难以理解和解释宏条形码观测数据的复杂性，阻碍了其生态学解读，并限制了其与其他生态数据类型的整合。
在本研究中，研究人员利用模拟和实验观测数据表明，重复宏条形码观测之间的变异性与样本中DNA的绝对数量密切相关。随后，研究人员基于宏条形码reads的均值与方差关系，开发了一个用于从宏条形码观测数据估计DNA丰度的一般性统计模型。
研究人员证明，该模型能够利用模拟数据和实验构建的DNA样本有效估计DNA丰度。该模型可同时应用于单一标记或多个标记，从而允许直接整合来自同一生物样本的多个遗传标记的信息。
绝对DNA丰度估计是将DNA观测与生物体丰度或生物量联系起来的逻辑单位。本方法可用于连接多种类型的DNA观测数据，或将DNA观测与非遗传的生态系统调查方法联系起来。然而，“DNA生态学”的重要方面仍未得到解决，这可能限制将观测到的浓度普遍地用于推断生物体丰度。
宏条形码（metabarcoding）是指对混合模板DNA进行PCR扩增与高通量测序，从而同时观测多个分类单元序列的技术，在环境DNA（environmental DNA, eDNA）研究中应用广泛。此类数据通常以reads计数表形式出现，即每个分类单元或序列变体对应的序列读数。尽管reads看似包含定量信息，但宏条形码数据本质上是组成性（compositional）数据：样本内各分类单元的reads比例互不独立，且受到PCR扩增效率差异、样本DNA总量、测序深度、实验室步骤等多重因素影响，因此难以直接用于传统的群落生态学分析。目前常用的处理策略包括直接使用reads数或read比例、平方根等变换、双归一化、添加已知浓度内标（spike-in），或转化为存在/不存在后进行占用模型（occupancy model）分析。然而，这些方法要么丢失定量信息，要么难以克服组成性带来的统计问题，要么假设检测概率恒定且忽略观测间的非独立性。此外，当研究人员使用多个遗传标记（marker）时，不同标记产生的组成性数据集仅有部分分类单元重叠，缺乏统一的分析框架，导致获得的信息量增加但可解释性反而下降。因此，急需一种能从重复宏条形码观测中提取绝对DNA丰度信息，并能联合多个标记进行分析的统计方法。
研究人员利用计算机模拟和实验室构建的mock样本（已知DNA组成的样本）系统研究了重复宏条形码观测的变异模式。模拟采用两阶段框架：先从泊松分布抽样模拟等分试样中的DNA拷贝数，再通过对数线性PCR扩增模型和多项分布测序抽样生成reads。实验样本来自美国华盛顿州的34种海洋物种（32种海水鱼和2种海洋哺乳动物）构成的6个mock样本，每个样本制备未稀释、1:10、1:100和1:1000四种浓度梯度，共24个样本；每个样本设3个重复等分试样，分别用MiFish Universal（MFU）和MarVer1（MV1）两个线粒体12S标记扩增后独立测序，每个样本测序深度平均约10万reads。通过分析发现，重复观测之间的变异性与样本中可扩增DNA的绝对拷贝数密切相关：拷贝数越低，重复样本间的reads比例变异性越高。基于这一规律，研究人员建立了一个贝叶斯统计模型，利用reads比例的均值—方差关系估计每个分类单元的期望DNA拷贝数和样本总拷贝数。模型采用beta-二项分布描述reads观测，纳入相对扩增效率、总拷贝数、序列深度等参数，可同时应用于单个标记或多个标记，并能通过已知浓度的样本校准相对扩增效率。
研究结果分为两部分。3.1 模拟与mock样本研究显示：3.1.1 检测概率方面，模拟和mock样本均表明，当测序深度较高（>10,000 reads）时，分类单元未被检出的主要原因是其DNA绝对拷贝数过低，而非相对稀有度；mock样本中，缺失事件仅出现在总拷贝数低于约100拷贝或单分类单元低于约10拷贝的样本中。3.1.2 重复间变异性方面，reads比例的均值—标准差关系随总DNA拷贝数变化，总拷贝数低时重复间变异大，总拷贝数高时重复间变异小，且该模式在模拟数据与两种标记的mock样本数据中均一致，说明重复间的变异性携带了绝对丰度信息。3.2 DNA拷贝数估计方面：3.2.1 模拟测试中，对100次模拟重复的30分类单元样本，模型对各分类单元期望拷贝数的估计与真实值高度接近（接近1:1线），但低于约3拷贝的分类单元估计不确定性较大；总拷贝数估计的中位比例误差约为0.05。3.2.2 mock样本交叉验证中，模型综合MFU和MV1两个标记的数据后，对总DNA和单个分类单元拷贝数的估计均与真实输入值接近；在21个验证样本中，16个样本的总拷贝数90%后验区间覆盖了真实值，但两个未稀释样本的总拷贝数被低估，研究人员未找到明确原因。
讨论部分指出，该框架为从重复宏条形码观测中获取可扩增DNA拷贝数（amplifiable DNA copies）提供了统一途径，也为联合多个遗传标记的生态学推断奠定了基础。它还能解释eDNA研究中常见的现象：低DNA浓度样本的重复间高变异性并非数据质量不佳，而是分子随机抽样和PCR过程的正常结果。同时，研究人员也承认局限性：扩增效率变异仍需依赖已知混合样本校准；高浓度样本可能因PCR抑制而导致丰度低估；模型存在轻度的估计偏倚。展望方面，DNA浓度估计可直接与单物种qPCR或微滴式数字PCR（ddPCR）数据连接，从而将多种环境遗传数据统一到同一个定量框架中；未来还可构建数十个分类单元的空间或时空DNA浓度模型，并整合目视或声学等非遗传调查数据，以提升对物种丰度与分布的联合估计能力。原文结论部分可翻译为：DNA浓度也可以通过单物种qPCR和ddPCR直接测量，这意味着多种环境遗传数据现在可以连接在一起；建立数十个分类单元的DNA浓度空间或时空定量模型，并将其与其他观测类型相联系，所得丰度与分布联合估计有望提高昂贵野外调查的信息价值。
