AEX-1：一种经过改良的Vero细胞株，其对流感病毒复制的允许性更强

《Vaccine》：AEX-1: A Vero cell variant with enhanced permissiveness for influenza virus replication

　　

摘要

背景

能够提高流感病毒复制能力的连续细胞培养基对于疫苗开发和生产具有重大意义。Vero细胞具有良好的细胞调控记录；然而，它们较低的流感病毒生产率限制了其更广泛的应用。

方法

我们通过将Vero细胞与鸡胚胎羊膜片段共培养，开发出了AEX-1细胞系。评估了细胞的形态、细胞内酸化程度、流感病毒复制情况、转录组特征、遗传稳定性以及致肿瘤性。

结果

与亲本Vero细胞相比，AEX-1细胞表现出不同的形态和更强的内体和溶酶体酸化能力。在流感疫苗病毒生产的常用收获时间（感染后72小时），AEX-1细胞生产的传染性滴度更高，接近世界卫生组织推荐的A/Sydney/5/2021 (H1N1)pdm09和B/Austria/1359417/2021疫苗病毒的标准滴度，并且比Vero细胞的产量高出0.9–1.7 log₁₀ EID₅₀/ml。对于携带适应性HA G53D突变的A/Croatia/10136RV/2023 (H3N2)疫苗病毒或A/duck/Vietnam/NCVD-1584/2012 (H5N1)疫苗株，没有观察到复制优势。然而，缺乏G53D突变的A/Darwin/9/2021衍生的原始Vero分离株A/Austria/1516645/2022 (H3N2)的传染性滴度比Vero细胞高3.0 log₁₀ TCID₅₀/ml，比MDCK细胞高2.3 log₁₀ TCID₅₀/ml。基于H1N1 UniFluVec的流感病毒载体在AEX-1细胞中也能够高效复制。转录组分析显示，参与质子转运、囊泡酸化和细胞内pH调节的基因发生了变化。AEX-1细胞在长时间传代后仍保持遗传稳定性，在体外和体内均未显示出明显的致肿瘤性增加。

结论

增强细胞内酸化可能有助于提高AEX-1细胞中的流感病毒复制效率，这表明调节内体酸化可能为开发改进的流感疫苗生产细胞培养基提供合理策略。

引言

流感疫苗是全球生产最广泛的生物制品之一，目前仍主要依赖于鸡胚（CE）进行生产。尽管基于鸡胚的生产平台成熟且非常成功，但它存在一些局限性，包括对鸡胚供应的依赖性、在大流行情况下的灵活性较低，以及与细胞培养相比，疫苗对变异病毒的有效性较低[1],[2]。因此，开发能够支持高效流感病毒繁殖的改进型连续细胞培养基仍然是推动流感疫苗生产技术进步的重要目标。

在现有的连续细胞培养基中，Madin–Darby犬肾（MDCK）细胞是唯一用于许可流感疫苗生产（Flucelvax）的细胞系[3],[4]。表达人α2,6-唾液酸转移酶的MDCK和MDCK-SIAT1细胞也广泛用于流感病毒分离，因为它们通常能更好地保持 circulation strains 的遗传特性[5]。尽管如此，继续开发其他特性明确的细胞培养基仍然具有重要意义，因为不同的细胞平台具有不同的生物学特性、生产特性和监管优势。Vero细胞系源自非洲绿猴肾，具有丰富的监管历史，广泛用于生产脊髓灰质炎、狂犬病、日本脑炎、埃博拉和COVID-19等疫苗[6],[7],[8]。然而，传统的Vero细胞通常支持的流感病毒传染性滴度低于优化的MDCK生产细胞系，且通常需要进一步调整病毒和生产过程，这限制了其在流感疫苗生产中的更广泛应用[9]。尽管如此，几种基于Vero的流感疫苗候选株，包括针对高致病性禽流感的疫苗，已经证明了该平台的技术可行性，并展示了进一步优化的潜力[10],[11]。这些观察结果表明，提高Vero细胞对流感病毒复制的天然适应性可能会进一步增强其作为疫苗生产培养基的实用性。

流感病毒的有效进入需要受体介导的内吞作用，随后由内体 compartments 的酸化（pH值约为5.0–6.0）触发膜融合[12]。因此，细胞内和内体的pH值是流感病毒传染性和复制效率的关键决定因素。尽管Vero细胞和MDCK细胞的内体pH值尚未得到全面确定，但有研究表明，Vero细胞的内体 compartments 相对较不酸，从而对增加HA膜融合pH阈值的HA突变施加了更大的选择压力[13],[14],[15],[16]。这种细胞培养适应性突变可能会改变HA的融合特性，降低病毒颗粒的稳定性，并可能影响疫苗的质量[15],[16],[17]。因此，提高Vero细胞的内体酸化水平是一种合理的策略，既可增强流感病毒的繁殖效率，又可能减少对HA适应性突变的选择压力。

在这里，我们描述了AEX-1细胞系的建立和生物学特性。AEX-1是一种稳定的Vero细胞变体，是在将亲本Vero细胞与鸡胚胎羊膜片段长时间共培养过程中产生的。与亲本Vero细胞相比，AEX-1具有不同的形态和更酸性的细胞内环境。我们证明，在无血清培养条件下，AEX-1在感染后72小时能够支持更高的代表性流感A和B疫苗病毒（包括世界卫生组织推荐的疫苗株和流感病毒载体）的传染性滴度。此外，AEX-1在感染后72小时对原始A(H3N2)临床分离株的支持传染性滴度显著高于亲本Vero细胞和MDCK细胞。总体而言，这些发现表明AEX-1是一种稳定且生物学上独特的Vero细胞变体，具有用于流感病毒分离、繁殖和疫苗开发的潜力。

章节摘录

病毒

本研究中使用的病毒包括 IVR-229，这是一种由WHO推荐的高生长率蛋源重组疫苗病毒，代表A/Sydney/5/2021 (H1N1)pdm09株。IVR-229包含了原始分离株A/Sydney/5/2021 (H1N1)pdm09的HA和NA基因以及A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (A/PR/8/34)的六个内部基因。BVR-26 是一种由WHO推荐的High-growth率蛋源重组B型流感（Victoria谱系）候选疫苗病毒

AEX-1 Vero细胞变体的建立和初步表征

AEX-1 Vero细胞变体是在尝试通过将Vero细胞与鸡胚胎羊膜片段共培养来改善B型流感病毒在传统Vero细胞中的拯救效果的过程中产生的。出乎意料的是，在未感染的对照培养中，暴露于羊膜片段的Vero细胞比未使用羊膜片段的对照培养存活时间显著更长，并逐渐发展出独特的形态和生长模式。

讨论

在本研究中，我们描述了具有独特生理特性的新型Vero细胞AEX-1的生成和特性。与亲本Vero细胞相比，AEX-1在WHO推荐的流感A(H1N1)和B疫苗病毒的预定收获时间（72小时）内产生了显著更高的传染性滴度，尤其是在感染起始时病毒稀释度较低的情况下。相比之下，传染性滴度没有显著差异

作者仅使用OpenAI来改进手稿的语言清晰度。

CRediT作者贡献声明

Artem Krokhin：可视化、方法学、数据分析。Julia Romanova：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据分析。Regina Grillari：数据分析、研究。Matthias Hackl：数据分析、研究。Pavel Korabliov：数据分析、研究。Jozef Mandík：数据分析、研究。Andrej Egorov：概念构思、数据分析、研究、方法学、项目管理

动物实验

本研究遵循了以下动物福利和/或报告指南：欧洲议会和理事会于2010年9月22日发布的欧盟指令2010/63/EU，关于用于科学目的的动物保护。

注：此处应补充具体遵守的动物福利和报告标准，但原文本中未提供。

本研究获得了斯洛伐克共和国兽医管理局（?.k. Ro-7406/2024-220）和斯洛伐克医科大学实验动物伦理委员会（批准编号EK SZU/007/2024）的批准。

资金来源

所有体外实验和小鼠体内的研究均由Capricorn Technologies GmbH（奥地利）资助。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益和个人关系：Julia Romanova负责病毒培养和手稿撰写。Andrej Egorov提出了创建AEX-1细胞的想法，并与Artem Krokhin一起完成了大部分涉及该细胞系的实验室工作。他们与一项名为“AEX-1：一种具有酸化细胞内 compartments 的Vero衍生细胞系”的PCT申请相关联

致谢

作者感谢所有为这项研究做出贡献的技术人员和合作者。

Artem Krokhin|Julia Romanova|Regina Grillari|Matthias Hackl|Pavel Korabliov|Jozef Mandík|Andrej Egorov