平喘宁通过ADORA2A/cAMP/PKA/NLRP3轴减轻哮喘的机制：基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS血清药物化学与网络药理学分析

《Biomedical Chromatography》：Mechanism of Pingchuanning in Attenuating Asthma Based on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and Network Pharmacology Analysis

　　

采用超高效液相色谱-四极杆-Orbitrap高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）方法表征平喘宁（PCN）汤剂及其在哮喘大鼠体内的入血血清成分。在PCN中共鉴定107个化合物，其中36个原型成分在大鼠血清中检出。对这些吸收成分的网络药理学和分子对接预测ADORA2A为核心治疗靶点，5-O-methylvisammioside、nobiletin、sec-O-glucosylhamaudol和9-oxo-ODE显示结合亲和力。在卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘大鼠模型中，PCN缓解气道高反应性和肺部炎症。机制上，PCN上调ADORA2A，升高cAMP和PKA磷酸化，并抑制NLRP3表达。该基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的血清药物化学方法有效识别PCN的生物活性成分，整合策略表明PCN通过ADORA2A/cAMP/PKA/NLRP3轴发挥抗哮喘作用。

哮喘是一种以非特异性气道炎症和支气管高反应性为特征的慢性气道疾病，临床表现为反复喘息、气短、胸闷和咳嗽。吸入糖皮质激素和β₂-肾上腺素受体激动剂仍是一线治疗，但长期使用存在依从性、药物依赖、不良反应及对气道重塑干预不足等问题。中医整体调节和多靶点干预在哮喘管理中具有优势。平喘宁（PCN）由射干麻黄汤和三子养亲汤化裁而来，含11味药，临床用于温肺化痰、止咳平喘，但其药效物质基础及调控NLRP3的确切机制不清。为此，研究人员整合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS、网络药理学、分子对接和体内实验，旨在表征PCN化学轮廓及哮喘大鼠入血成分，筛选潜在活性成分和靶点，并验证其抗哮喘机制。研究结论为PCN通过ADORA2A/cAMP/PKA/NLRP3轴减轻哮喘，为其临床应用和机制研究提供依据。

技术方法方面，研究人员采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS（超高效液相色谱-四极杆-Orbitrap高分辨质谱）full MS/dd-MS²模式表征PCN及哮喘大鼠血清吸收成分；构建网络药理学框架，联合SwissTargetPrediction、GeneCards、DisGeNET、DrugBank、PharmGKB、OMIM、TTD、STRING、Cytoscape和DAVID进行靶点预测、蛋白-蛋白相互作用（PPI）拓扑分析及基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集；用AutoDock/Vina和PyMOL开展分子对接；建立56只雄性SD大鼠OVA（卵清蛋白）联合冷刺激哮喘模型，设Control、Model、PCN-L/M/H、Dex（地塞米松）、GLKCN（桂龙咳喘宁）组（n=8），进行Penh（增强呼气间歇）、EF₅₀（50%肺活量时呼气流量）、H&E、ELISA、qRT-PCR和Western blot验证。SD大鼠购自河南Skbex Biotechnology Co. Ltd.，经安徽中医药大学医学实验动物伦理委员会批准。

3.1 平喘宁化学组成的阐明：通过UHPLC-Q-Orbitrap HRMS full MS/dd-MS²采集，共鉴定107个化合物，涵盖黄酮、香豆素、生物碱、有机酸、氨基酸等。
3.2 平喘宁入血成分的鉴定：通过比较空白血清与给药血清总离子流图及保留时间、精确质量、MS/MS碎片，鉴定36个入血化合物，作为潜在直接作用成分。
3.3.1 疾病靶点构建：SwissTargetPrediction预测并去重得507个PCN潜在靶点，从六个疾病库整合去重得9321个哮喘相关靶点，交集得349个潜在抗哮喘靶点。
3.3.2 PPI网络构建：基于STRING构建349节点PPI网络，Cytoscape/CytoNCA按拓扑参数映射节点重要性。
3.3.3 GO和KEGG富集分析结果：DAVID得835个GO条目、181条KEGG通路，显著涉及神经活性配体-受体相互作用、癌症通路和钙信号通路等。
3.3.4 “PCN–靶点–疾病”网络构建：DC过滤后网络含37个活性成分节点和116个核心靶点节点，前十包括ADORA2A、ADORA3、CA1、CA2、CA9、CA12、CACNA2D、GABBR、SLC22A6、LTA4H。
3.3.5 分子对接验证：5-O-methylvisammioside、9-oxo-ODE、nobiletin和sec-O-glucosylhamaudol与ADORA2A显示中等结合亲和力，结合能为?4.67、?4.17、?3.96和?3.82 kcal/mol；阳性对照CGS21680最佳对接结合能为?5.48 kcal/mol。
3.4.1 对体重和气道反应性的影响：OVA攻击后大鼠出现呼吸急促、喘息等；PCN改善体重增长，降低Ach（乙酰胆碱）递增浓度下Penh，改善EF₅₀及呼吸流波形，表明PCN减轻气道高反应性。
3.4.2 PCN改善肺组织病理损伤并降低炎症细胞因子水平：H&E显示模型组肺泡萎缩、塌陷、融合、肺泡壁增厚、支气管平滑肌肥厚、管腔狭窄、上皮细胞脱落及炎细胞浸润，PCN组不同程度改善。
3.4.3 PCN影响哮喘大鼠肺组织和BALF细胞因子分泌：ELISA/qRT-PCR显示模型组TNF-α、IL-1β、IL-18及IL-1β/IL-18比值显著升高，PCN-L、PCN-H、GLKCN和Dex降低这些指标；PCN-H和GLKCN对TNF-α和IL-1β抑制更明显。
3.4.4 Western blot分析：模型组ADORA2A、cAMP和p-PKA/PKA降低、NLRP3升高；PCN剂量依赖上调ADORA2A、cAMP和p-PKA/PKA并抑制NLRP3，表明激活ADORA2A/cAMP/PKA并抑制NLRP3炎症级联。

讨论部分总结：作者指出现有吸入激素和β₂-肾上腺素受体激动剂长期应用存在依赖、不良反应及气道重塑干预不足；PCN源于经典方，体现宣肺化痰、降气止咳平喘和补虚。作者承认入血成分中内源性氨基酸、有机酸和核苷可能造成靶点预测偏倚，需定量代谢组学区分外源吸收与代谢反应；ADORA2A为核心靶点，四种香豆素/黄酮类为核心活性成分；低剂量对TNF-α作用有限，可能为阈值效应。OVA联合冷刺激模型模拟过敏性哮喘免疫失衡、慢性气道炎症、高反应性和病理损伤；PCN修复免疫器官、抑制异常T细胞增殖和Th2极化、降低IL-4/IL-5、纠正Th1/Th2失衡，并经ADORA2A→cAMP→PKA→NLRP3轴抑制IL-1β、IL-18释放。作者还讨论cAMP下游Ca²⁺及Gβγ、Epac分支可能参与气道重塑，但为初步假设。局限性包括ADORA2A未用基因敲除或特异性拮抗/激动剂验证、Gβγ-Epac-Ca²⁺交互未做机制挽救、核心成分单独及协同作用不清、吸收成分药代动力学和组织分布未系统研究。

研究结论翻译：本研究从PCN中鉴定107个化合物，其中36个在哮喘大鼠血清中检出。网络药理学和分子对接确定ADORA2A为关键治疗靶点，4个化合物（5-O-methylvisammioside、nobiletin、sec-O-glucosylhamaudol和9-oxo-ODE）显示中等结合亲和力。体内实验证实，PCN恢复体重、缓解气道高反应性和肺组织损伤、降低炎症细胞因子水平、上调ADORA2A表达、升高cAMP水平、增加PKA磷酸化并下调NLRP3表达。这些发现初步阐明PCN治疗哮喘的药效物质基础及潜在机制，为进一步开发PCN奠定基础。本研究也存在一定局限性：关键靶点ADORA2A主要通过网络药理学和分子对接确定，但未使用靶点敲除或特异性抑制剂在体内证实其必要性。此外，尽管4个化合物与ADORA2A显示较强结合亲和力，但其对PCN治疗作用的单独或协同贡献尚未经实验验证。另外，36个吸收成分的药代动力学特征，包括其在血清中的实际浓度和代谢稳定性，尚未测定。最后，本研究聚焦ADORA2A/cAMP/PKA/NLRP3通路，未探索PCN其他可能信号通路或脱靶效应。研究人员将在后续实验中进一步完善这些方面。