《Talanta》：Comprehensive characterization of regulated and emerging marine toxins by UHPLC-IM-QTOF using automated MS/MS and collision cross section measurements
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海洋毒素（又称生物毒素或藻毒素）是主要由海洋微藻（包括甲藻和硅藻）及某些细菌产生的天然次生代谢产物。这些天然产物在结构、生物活性和溶解度方面表现出高度多样性，通常被分类为亲水性（如软骨藻酸(DA)和石房蛤毒素(STXs)）、亲脂性（如冈田酸(OA)、原多甲藻酸
海洋毒素（又称生物毒素或藻毒素）是主要由海洋微藻（包括甲藻和硅藻）及某些细菌产生的天然次生代谢产物。这些天然产物在结构、生物活性和溶解度方面表现出高度多样性，通常被分类为亲水性（如软骨藻酸(DA)和石房蛤毒素(STXs)）、亲脂性（如冈田酸(OA)、原多甲藻酸(AZAs)、扇贝毒素(YTXs)、短裸甲藻毒素和雪卡毒素）或两亲性（例如迈托毒素和沙海葵毒素），其分子量范围约为300至超过3000 Da。
鉴于其结构多样性（包括分子大小、官能团、立体化学和三维构象的差异），这些化合物能够与多种生物受体和代谢途径相互作用，从而产生广泛的毒理学和药理学效应。事实上，一些海洋毒素已被研究用于潜在的治疗应用，包括抗肿瘤和抗炎活性。然而，它们更为广泛地被认知的是其毒性。海洋毒素可在贝类、鱼类及其他海洋生物体内蓄积，并通过食物摄入导致人体中毒。根据观察到的症状，主要中毒综合征包括麻痹性、神经毒性、遗忘性、腹泻性及雪卡毒素鱼类中毒。
为防止中毒，全球范围内已实施监管限量和监测计划。在此背景下，海洋毒素的化学多样性促进了多种检测分析方法的验证。对于STXs（麻痹性贝毒(PSTs)），常用技术包括基于荧光的液相色谱法（柱前氧化液相色谱-荧光检测，Pre-COX-LC-FLD，及柱后氧化LC-FLD，PCOX-LC-FLD）。DA通常采用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)或ELISA进行检测，而亲脂性毒素（AZAs、YTXs、OA和鳍藻毒素(DTXs)）通常采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。尽管有多种方法可用，但目前尚无单一程序被广泛采用以实现亲水性和亲脂性毒素的同时检测。此前已有研究提出一种UHPLC-MS/MS方法以弥补这一空白，能够对多种化合物进行定性和定量。然而，该方法无法区分OA及其类似物DTX-2，因为这两种化合物共洗脱且具有相同的质量数。这在欧洲法规背景下构成重大局限，因为不同的毒素等效因子(TEFs)被应用于这些类似物，使其区分至关重要。
常规分析方法仍面临重要局限，包括基质效应、认证标准品（尤其是新型毒素）的可得性有限，以及难以分离结构相关或同量异位毒素。这些挑战在监管监测计划中尤为关键，因为准确的毒素鉴定对于确保食品安全至关重要。此外，毒素类似物数量的增加及其在海洋生物体内的转化为其检测和风险评估增加了额外的复杂性。近年来质谱技术的进步可以克服其中部分挑战。特别是，高分辨质谱(HRMS)平台（如四极杆飞行时间(QToF)系统）的发展使得在单次运行中实现靶向和非靶向分析成为可能，提供精确质量测量和更强的结构解析能力。这些仪器支持回顾性数据分析，并通过全扫描采集和MS/MS碎裂数据促进未知或新型毒素的鉴定。此外，谱图匹配方法的改进，包括碎裂模式的使用、离子比率评估以及碎裂树比对等计算工具，增强了化合物鉴定的置信度。
近年来，离子淌度-质谱(IM-MS)已成为一种强大的分析技术，它不仅根据离子的质荷比进行分离，还依据离子在气相中的尺寸、形状和电荷进行分离。目前，有多种离子淌度谱技术可供使用，包括漂移管(DTIMS)、高场不对称波形(FAIMS)/差分淌度分析(DMA)、俘获(TIMS)和行波(TWIMS)离子淌度谱。根据不同技术，分离基于离子在电场作用下通过缓冲气体时的迁移差异或通过施加补偿电压实现。由于这种气相运动受离子的三维构象及其与气体分子相互作用的影响，IM-MS能够提供碰撞截面积(CCS)值，作为结构指纹。增加的分离维度使得IM-MS在区分无法仅靠质谱分辨的同量异位和同分异构化合物方面具有特殊价值。
IM-MS已开始被探索作为解决海洋毒素相关分析挑战的补充方法。对PSTs的研究表明，IM可用于某些类似物的分离，但紧密相关的异构体（如膝沟藻毒素(GTX)差向异构体）仍难以分辨。已提出不同策略，包括使用替代漂移气体(CO?或N?O)和碱金属阳离子化(Li?、Na?、K?)来改善离子分离和结构区分。此外，DMS/FAIMS已被应用于减少复杂样品中的基质干扰，而TIMS等更先进的方法已被用于获取较大毒素的结构信息。
尽管取得了这些进展，目前的IM-MS应用仍主要集中于特定毒素组或靶向分析流程，仍然缺乏能够在单一方法中同时分析亲水性和亲脂性海洋毒素的综合方法。在此背景下，本研究旨在开发一种统一的IM-HRMS方法，利用IM提供的额外气相分离来提高选择性、结构表征能力和化合物鉴定置信度，实现对两类毒素的同时检测。
**基于UHPLC-IM-QTOF的受监管及新型海洋毒素综合表征研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
海洋毒素是由海洋微藻等产生的次生代谢产物，依据溶解性可分为亲水性毒素（如DA、STXs）、亲脂性毒素（如OA、AZAs、YTXs等）及两亲性毒素。由于这些化合物可通过贝类等海产品蓄积并导致人类中毒，全球各国已建立相应的监管限量和监测体系。目前针对不同毒素类别，通常采用不同的分析方法：STXs多用柱前或柱后氧化液相色谱-荧光检测，DA多用HPLC-UV或ELISA，亲脂性毒素多用LC-MS/MS。然而，上述方法均存在明显局限：尚无单一方法能同时检测亲水性和亲脂性两大类毒素；已有的UHPLC-MS/MS方法无法区分共洗脱且质量数相同的OA及其类似物DTX-2，而欧盟法规对两者规定了不同的毒素等效因子，因此这一区分至关重要。此外，常规方法还面临基质效应干扰、新兴毒素标准品缺乏、结构类似物及同量异位毒素难以分辨等问题。近年来兴起的离子淌度-质谱联用技术依据离子在气相中的尺寸、形状和电荷进行额外分离，可提供碰撞截面积(CCS)值作为结构指纹，已有研究探索其用于PSTs分析，但仅限于特定毒素组或靶向流程。因此，本研究旨在开发一种统一的IM-HRMS方法，实现亲水性与亲脂性海洋毒素的同步检测，利用IM的额外气相分离维度提升选择性、结构表征能力和鉴定置信度。
**二、研究内容与主要技术方法**
研究人员基于实验室前期优化的UHPLC-MS/MS方法，将其转移至更先进的1290 Infinity III UHPLC系统，并耦合Agilent 6560C IM Q-TOF质谱仪。色谱分离采用ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC柱，以甲酸-甲酸铵-乙腈体系进行梯度洗脱。方法开发涵盖全扫描、自动MS/MS和IM非靶向碰撞能量三种采集模式。主要关键技术包括：（1）自动MS/MS采集，以4 m/z隔离窗口和多重固定碰撞能量（正离子模式10/20/40 eV，负离子模式20/30/40 eV）对色谱运行中检测到的最强前体离子进行自动碎裂，获取精确质量MS/MS谱图；（2）离子淌度分离，以氮气为漂移气体，采用交替帧采集策略，第二帧碰撞能量随漂移时间梯度升高的方式实现淌度分辨的碎裂分析；（3）单场CCS校准，使用Agilent ESI Tune Mix标准品进行外部校准，通过IM-MS Browser软件计算CCS值。LOD通过各毒素组在正负离子模式下的外标校准曲线确定（信噪比≥3）。标准品来源为Cifga公司提供的认证参考物质，涵盖14种PSTs、DA、TTX、OA、DTX-1/2、YTXs、AZA-1-3及SPXs等。此外还使用了贻贝组织（Mytilus galloprovincialis）认证参考物质用于基质评价。
**三、研究结果**
**3.1 方法转移与色谱性能**
研究人员将前期方法的色谱条件成功转移至新系统，亲水性和亲脂性毒素在正负离子模式下均获得有效电离。亲水性毒素（DA、STX组、TTX）在ESI?中主要形成[M+H]?离子；部分硫酸化PST类似物表现出不同的电离途径，GTX5主要检测为[M-SO?+H]?，GTX6主要检测为[M+K]?加合物。亲脂性毒素中，AZAs在正离子模式下响应最佳，YTXs和OA组在负离子模式下信号最强，SPXs主要以[M+H]?检出。GTX-1/4、GTX-2/3及其脱氨甲酰基衍生物、N-磺酰胺甲酰基毒素等关键PST类似物均保持色谱分离。
**3.2 自动MS/MS采集**
自动MS/MS模式成功生成了受监管亲脂性毒素的诊断碎片离子：OA产生m/z 113和255的特征产物离子，AZA-1产生m/z 824和806的诊断离子。DA的碎裂途径与文献一致，产生m/z 266、220和193特征离子。GTX5在正离子模式下检测到[M+H]?、[M+Na]?、[M+K]?及高丰度的源内脱磺酸基离子[M-SO?+H]?（m/z 300.1435），其产物离子m/z 282和204与STX标准品的碎裂行为一致，表明脱磺酸基后保留了特征的四氢嘌呤核心。负离子模式下GTX2产生m/z 376（脱水）、351（脱氨甲酰基胺）和333（二次脱水）的特征碎片。环状亚胺类毒素SPXs在所有碰撞能量下均稳定产生m/z 164的环状亚胺特征诊断离子，该离子在40 eV时丰度显著增加。TTX在20 eV下产生m/z 302，在40 eV下产生m/z 162诊断离子，两者均为EURLMB官方方法所采用的碎片。方法的局限是PSTs灵敏度较低，STX在9 ng/mL时仍可获得可解释的MS/MS谱图，而GTX1需约140 ng/mL；亲脂性毒素灵敏度优异，AZAs的LOQ低于0.8 ng/mL，SPXs的LOD低于0.4 ng/mL，TTX的LOD为1 ng/mL。此外，该方法无法明确区分异构体OA和DTX-2。
**3.3 IM-QTOF采集**
在优化的IM-QTOF条件下，OA漂移时间为37.89 ms，DTX-2为37.03 ms。虽然在淌度维度未实现完全基线分离，但漂移时间热图揭示了两个可区分的离子群，估测淌度分辨率为0.78，证实IM可作为正交维度辅助区分这对同量异位异构体。DTX-1因m/z不同且漂移时间更长（38.31 ms）而被清晰分辨。各毒素家族的漂移时间反映了结构特征：PSTs、TTX和DA的漂移时间最短（约18-24 ms），多聚醚类毒素（OA、DTXs、AZAs、YTXs）漂移时间较长，其中YTXs超过50 ms。该工作流还实现了淌度分辨的前体-产物离子关联：OA的特征碎片m/z 255与其前体离子具有相同漂移时间，AZA-2产生m/z 838和820的特征脱水产物离子。通过按漂移时间过滤数据，可有效去除共洗脱化合物产生的干扰碎片，获得更洁净的MS/MS谱图。该模式的局限是质量测量精度较常规QTOF略有下降，但PSTs的质量误差范围（2.20-11.67 ppm）仍足以满足鉴定目的。
**3.4 CCS测定**
采用单场校准法在氮气漂移气体中测得各毒素的DTCCS_N2值。实验CCS值覆盖152.6 ?2（dc-STX）至395.2 ?2（h-YTX）的宽范围，与分子大小呈正相关：亲水性毒素（PSTs、DA、TTX）CCS为153-192 ?2，多聚醚毒素约291-395 ?2，AZAs和SPXs居中（260-310 ?2）。结构修饰产生可重复的CCS差异，如DTX-1中额外甲基使其CCS较OA和DTX-2略大。与文献值比较：OA的CCS（297.5 ?2）与近期报道的TWCCS_N2值偏差3.5%，STX（160.96 ?2）偏差仅0.85%；与氦基CCS值的较大差异归因于漂移气体性质不同。精密度评价显示几乎所有化合物的CCS相对标准偏差(RSD)低于0.2%。
**3.5 贝类样品适用性**
在贻贝组织认证参考物质中，OA和DTX-1的提取液分析显示明显的基质效应，自动MS/MS优先选择高丰度基质离子而抑制了毒素前体的碎裂。通过设置优选质量数包含列表，强制采集算法在目标保留时间优先选择毒素前体离子，成功获取了OA和DTX-1的MS/MS谱图。与纯溶剂标准品相比，基质中OA和DTX-1的信号抑制分别为65%和83%。应用IM分离维度按特定漂移时间区域过滤数据后，大量m/z 200-400范围内漂移时间低于30 ms的干扰离子被有效排除，显著改善了谱图信噪比，恢复了清洁的前体离子信号及m/z 255诊断碎片。
**四、讨论与结论**
本研究表明，UHPLC-IM-QTOF工作流通过整合色谱保留时间、精确质量数、CCS和诊断碎片四重鉴定标准，显著提高了海洋毒素鉴定的置信度。IM成功弥补了LC-HRMS无法区分OA/DTX-2这一关键局限，同时淌度分辨的碎裂分析实现了可靠的前体-产物离子关联，即使产物离子相同也能通过前体漂移时间区分不同类似物。实验DTCCS_N2数据的建立填补了海洋毒素CCS数据库的重要空白，为靶向分析、回顾性数据查询和基于HRMS的新型毒素疑似筛查提供了稳健的正交鉴定参数。该方法的自动MS/MS模式在复杂基质中因优先选择高丰度离子的固有限制可通过优选质量列表部分克服，且IM过滤可有效降低基质干扰。研究存在一定局限，包括PSTs中GTXs灵敏度相对较低、方法对痕量低丰度未知物的全面筛查尚需补充数据非依赖采集等互补策略。总体而言，该研究为海洋毒素的综合监测提供了一种高效的多维分析方案，对食品安全监管和新兴毒素风险评估具有重要应用价值。
**研究结论**：研究人员成功开发了一种全面的UHPLC-IM-QTOF工作流，用于受监管和新型海洋生物毒素的同时表征。精确质量全扫描采集、自动MS/MS与离子淌度的结合提供了四种互补的鉴定标准（保留时间、精确质量、CCS和诊断碎裂），从而提高了毒素鉴定的置信度。IM成功解决了LC-HRMS方法的主要局限，通过区分异构体毒素OA和DTX-2，同时实现淌度分辨的碎裂分析以可靠地关联前体-产物离子。此外，研究人员为所有主要受监管海洋毒素组建立了实验性DTCCS_N2数据，提供了支持靶向分析、回顾性数据查询和新兴海洋生物毒素基于HRMS的疑似筛查的稳健鉴定参数。
