《Thrombosis Research》：A human-cell recombinant prethrombin-2 platform producing thrombin with enhanced fibrinogen processing for
in vitro applications
编辑推荐：
凝血酶是止血、免疫反应和炎症的核心介质。它由凝血酶原在凝血酶原酶切割R320–I321后产生，该切割触发了糜蛋白酶样丝氨酸肽酶典型的变构成熟。进一步加工产生生理上占主导地位的α-凝血酶（αT），其活性位点以催化残基S525为中心。尽管血浆来源的αT被广泛用于生
凝血酶是止血、免疫反应和炎症的核心介质。它由凝血酶原在凝血酶原酶切割R320–I321后产生，该切割触发了糜蛋白酶样丝氨酸肽酶典型的变构成熟。进一步加工产生生理上占主导地位的α-凝血酶（αT），其活性位点以催化残基S525为中心。尽管血浆来源的αT被广泛用于生物医学和生物技术，但它是异质的，并存在病原体或朊病毒传播风险，因此推动了重组替代品的开发。这些替代品主要依赖于次优的细菌或非人真核系统，而已有的人源细胞工作主要集中在凝血酶原或工程变体上。在此，研究人员报告了在Expi293F细胞中重组产生前凝血酶-2（PE2）（一种在αT上游保留13个残基的酶原）以及其催化受损的S525A对应物（PE2–S525A）。通过匹配的重组系统对ecarin（一种切割R320–I321的蛇毒金属肽酶）进行受控体外成熟，产生了有活性的PE2a和无活性的PE2a–S525A。PE2a表现出热稳定性、对生色底物S-2238的切割活性，以及在凝血酶时间测定中与商业人αT相当的性能。相比之下，它更有效地切割生理底物纤维蛋白原，包括其荧光素标记形式。新鲜PE2a在R284–T285处缓慢自溶，一周后产生αT。直接凝血酶抑制剂阿加曲班和达比加群进一步提高了热稳定性，同时有效阻断底物切割。这种全重组工作流程为基础血液学研究、结构生物学和体外抑制剂筛选提供了一个实用平台。
凝血酶是止血系统的关键效应肽酶，通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白并激活血小板来封闭受损血管。它还参与免疫血栓形成（immunothrombosis）和血栓炎症（thromboinflammation），与先天免疫和炎症信号通路紧密相连。目前，α-凝血酶（αT）是生理上占主导地位的凝血酶形式，也是生物医学和生物技术中广泛使用的试剂。然而，血浆来源的αT具有异质性，常与抑制剂或其他血浆蛋白共纯化，且存在病原体或朊病毒传播风险，因此开发重组替代品具有重要意义。过去的重组表达主要依赖大肠杆菌等细菌系统，这些系统缺乏翻译后修饰机制，且往往形成包涵体；非人真核细胞如中国仓鼠卵巢（CHO）和幼仓鼠肾（BHK）细胞虽能进行部分修饰，但会引入非人糖基化表位，且无法完全模拟人源细胞环境。人源细胞平台此前仅限于表达凝血酶原或其工程变体，尚未建立直接表达前凝血酶-2（PE2）并产生活性凝血酶的工作流程。为此，研究人员利用Expi293F细胞（一种悬浮生长的人胚肾细胞衍生平台）建立了重组PE2及其催化失活突变体PE2–S525A的生产体系，同时建立了匹配的重组ecarin（rEca）系统，用于在体外受控激活PE2。所得活性PE2a在生色底物活性和凝血酶时间测定中与商业人αT相当，但切割纤维蛋白原的效率更高，且具备明确组成和批次一致性，为基础血液学、结构生物学及抑制剂筛选提供了实用工具。
研究人员开展的研究主要分为几个阶段。首先，设计并克隆了PE2（T272–E579）和仅含轻链与重链（LC+HC，T285–E579）的构建体，并将PE2野生型及其S525A突变体成功表达于Expi293F细胞。其次，构建了三种重组前ecarin（rpEca）变体（M1、I21、V191），经活性比较选择全长M1用于生产，通过Strep-Tactin亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）纯化后，rpEca自激活为成熟rEca。随后，用商业或重组ecarin切割PE2的R320–I321键，获得高纯度双链PE2a和PE2a–S525A。最后，对成熟产物进行功能表征，包括对生色底物S-2238的切割动力学、对荧光素标记及天然纤维蛋白原的蛋白水解活性、热稳定性以及血浆凝血酶时间测定，并与商业血浆来源αT（cαT）进行比较。
在技术方法上，研究人员采用Expi293F细胞瞬时转染系统进行重组蛋白分泌表达，经固定化金属亲和层析（IMAC）和Strep-Tactin亲和层析以及SEC纯化。利用重组ecarin（rEca）在体外切割R320–I321实现PE2的成熟。通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）确认分子量和切割位点；采用差示扫描荧光（DSF）测定熔解温度；使用生色底物S-2238进行活性滴定和动力学分析，拟合采用2:2稳态速率方程；通过SDS-PAGE和荧光法评估纤维蛋白原切割；以凝血酶时间测定比较血浆环境中的凝固活性。该研究未涉及患者样本队列，所有血浆为商业正常对照血浆。
研究结果按原文小标题分述如下：
表达载体制备：研究人员设计了PE2（LC++HC，T272–E579）和LC+HC（T285–E579）两种凝血酶构建体，均带N端Igκ信号肽和C端六组氨酸标签。PE2构建体包含野生型和S525A、D419A/S525A突变体。此外，构建了三种重组前ecarin（rpEca）载体：M1（全长，含天然信号肽）、I21（缺失信号肽）、V191（缺失信号肽和前结构域）。经小规模活性比较，M1变体显示最高活性，被选为后续生产用构建体。
重组蛋白生产与纯化：在Expi293F细胞中，仅编码PE2和PE2–S525A的载体获得合理产量（约2.7和3.3 mg/L培养基）。两者经镍亲和色谱和SEC纯化后，用商业ecarin（cEca）在37°C处理16小时，得到高度纯化的成熟PE2a和PE2a–S525A，即R320–I321被切割、LC+和HC通过C293–C439二硫键连接的双链形式。质谱确认单链PE2及双链成熟产物的分子量与理论值一致。PE2a在37°C放置一周后经R284–T285自溶产生约50%的αT。差示扫描荧光显示PE2a和PE2a–S525A的熔解温度（Tm）为57–58°C，与文献报道的αT（58°C）相当。
对生色底物的功能评估：PE2a以浓度依赖方式切割S-2238，而失活的PE2a–S525A无活性。直接凝血酶抑制剂中，苯甲脒为弱抑制剂（在5 mM时仅部分抑制），而阿加曲班（10–100 μM）和达比加群（10–50 μM）在较低浓度即完全抑制底物切割。阿加曲班和达比加群与PE2a形成稳定复合物，使Tm由约57°C升高至64°C。动力学研究表明，S-2238水解遵循2:2稳态速率方程，拟合得到表观Km=14.6 μM、kcat=6.5 s?1、kcat/Km=4.5×10^5 M?1 s?1。这一表观效率低于文献中αT的约10^7 M?1 s?1，但文献值基于米氏模型拟合，两者不可直接比较。
对纤维蛋白原的功能评估及与商业αT的比较：PE2a切割FITC标记的纤维蛋白原，反应可被阿加曲班抑制；PE2a–S525A无此活性。SDS-PAGE显示，PE2a在约2小时开始降解非标记纤维蛋白原，而商业cαT需约22小时。通过活性位点滴定，研究人员将PE2a活性归一化为0.7 U/mL PE2a约等于2.8 U/mL cαT。在新鲜制备及?80°C储存24小时或1周后，PE2a对FITC-纤维蛋白原的切割均显著优于cαT，这一差异归因于cαT中含有白蛋白等额外组分影响酶效率。
凝血酶时间测定：采用同一血浆池和单位匹配的酶，PE2a和cαT的凝血酶时间分别为17.7秒和17.9秒，误差内无差异，表明两者在血浆环境中的纤维蛋白原凝固活性相当。
讨论与结论：本研究的讨论部分指出，PE2a相对于血浆来源αT具有组成明确、批次间均一、无载体蛋白等优势，适合作为功能、结构和抑制剂筛选研究的试剂。生产流程基于商品化Expi293试剂和Addgene存放的质粒，易于在标准分子生物学实验室实施。研究结论为：研究人员在Expi293F细胞中建立了PE2和PE2–S525A的重组生产系统，两者均能被商业或重组ecarin高效成熟为PE2a和PE2a–S525A。成熟变体热稳定，PE2a对生色底物S-2238的活性和在凝血酶时间测定中与cαT相当，但对天然和荧光标记纤维蛋白原的切割效率更高。直接凝血酶抑制剂阿加曲班和达比加群通过紧密结合抑制底物切割并显著提高PE2a的稳定性。综上，PE2a为体外基础血液学研究、结构生物学和抑制剂筛选提供了一个实用且优越的重组平台。
