F7 c.760T>C（FVII p.Cys254Arg）突变通过破坏二硫键并损害分泌导致遗传性FVII缺陷

《Thrombosis Research》：The Factor VII mutation F7 c.760T>C (FVII p.Cys254Arg) is causative for Factor VII deficiency by impairing secretion

　　

背景：遗传性凝血因子VII（FVII）缺陷是一种由F7基因突变引起的出血性疾病，其诊断因基因型-表型相关性较弱而复杂化。然而，准确评估FVII变异的致病性对于有效临床管理至关重要。目的：在此，研究人员报告由F7 c.760T>C突变导致的FVIIp.Cys254Arg变异。该突变在两个患者（父亲和儿子）中发现，二者均表现为FVII缺陷。研究人员旨在确定导致其潜在致病性的分子机制。方法：采用计算机分析（in silico analysis）以及体外表达系统（in vitro expression system）对FVIIp.Cys254Arg变异进行表征。使用蛋白质印迹（Western blotting）、生物发光蛋白定量测定（bioluminescent protein quantification assay）和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy）研究重组FVII蛋白的亚细胞定位和分泌。结果：FVIIp.Cys254Arg变异导致蛋白酶结构域中靠近催化三联体（catalytic triad）的一个二硫键丢失，可能使三级蛋白结构（tertiary protein structure）不稳定。这导致分泌受损，如在HEK293T细胞中所示，并进一步得到与突变共分离的患者FVII缺陷的支持。结论：分子分析证实了计算机预测FVIIp.Cys254Arg变异具有高度致病性，并确立该突变为遗传性FVII缺陷的致病原因。

一、研究背景与问题
凝血因子VII（FVII）在血管损伤后与膜结合组织因子结合，启动外源性凝血途径并最终形成纤维蛋白凝块。遗传性FVII缺陷（OMIM #227500）为常染色体隐性出血性疾病，普通人群估计患病率为1:300,000至1:500,000。该病通常分为I型（FVII凝血活性FVII:C和FVII抗原FVII:Ag均降低）和II型（FVII:C降低而FVII:Ag正常）。临床表现从轻度至重度出血不等，但约三分之一患者终生无症状。FVII为维生素K依赖性糖蛋白，主要在肝脏合成并以酶原形式分泌；成熟蛋白含N端γ-羧基谷氨酸（Gla）结构域、两个表皮生长因子样结构域和C端蛋白酶结构域，分泌前需在内质网（ER）和高尔基体（Golgi）完成修饰。F7基因约15 kb、含9个外显子，位于13q34；已报道大量F7突变，以单核苷酸替换为主，也有缺失、重复、插入或插入缺失重排。由于基因型-表型相关性弱、残余FVII:C预测价值有限以及计算机预测工具存在局限，许多FVII变异仍被归类为意义未明变异（VUS），使出血风险评估和临床管理复杂化。该研究关注在男性患者及其父亲中以杂合状态存在的未表征F7 c.760T>C突变，并表征其导致的FVIIp.Cys254Arg对FVII胞吐的影响。此前Herrmann et al.曾报告一例携带该突变的俄罗斯患者并称其致病，但缺乏功能证据，且该患者还携带其他F7变异，难以判断p.Cys254Arg的独立影响。
二、研究开展、结论与意义
研究人员对同一家系中的父亲、母亲和儿子进行临床、遗传与蛋白功能分析，并以HEK293T细胞表达系统结合计算机预测，证明F7 c.760T>C导致的FVIIp.Cys254Arg通过破坏蛋白酶结构域中高度保守的Cys238-Cys254二硫键、影响蛋白稳定性并严重损害分泌，从而造成I型FVII缺陷。该研究为p.Cys254Arg的致病性提供了功能证据，支持将c.760T>C确立为遗传性FVII缺陷的致病突变，并有助于解释患者FVII:C和FVII:Ag降低的分子基础。
三、关键技术方法
研究样本来自同一白种人家系：母亲39岁、父亲40岁、儿子8岁；另以12名健康献血者作为FVII:Ag参考。方法包括靶向二代测序（NGS）分析F7编码序列及邻近内含子；一期凝固法测定FVII:C、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测FVII:Ag；在HEK293T细胞中表达FVII-GFP、FVII-HA、FVII-HiBiT及未标记FVII构建体；采用Western blotting、HiBiT/NanoBiT生物发光蛋白定量和共聚焦激光扫描显微镜分析蛋白表达、分泌及亚细胞定位；使用AlphaFold2进行结构可视化，并以PolyPhen-2、SIFT和AlphaMissense进行致病性预测；统计学采用Student’s t检验。
四、研究结果
（1）患者及遗传学发现：8岁男性因疑似遗传性FVII缺陷就诊，FVII:C为25%、35%和29%（参考范围79–119%）；遗传分析发现第8外显子杂合F7 c.760T>C，导致p.Cys254Arg。父亲FVII:C为28%，母亲为73%和64%（参考范围86–142%），母亲降低可能源于疑似的维生素K缺乏。父亲同时携带c.760T>C及额外杂合F7多态c.1238G>A（p.Arg413Gln，dbSNP rs6046），母亲测序区域未检出F7突变；父子间c.760T>C独立于c.1238G>A传递，提示父亲基因组中两变异呈复合杂合状态。FVII:Ag在父亲和儿子中分别为21%和29%，低于12名健康献血者参考范围62%–145%（均值96%），提示二者为I型缺陷。
（2）计算机预测与结构分析：PolyPhen-2评分1.000（probably damaging）、SIFT评分0.00（deleterious）、AlphaMissense致病性评分0.983（likely pathogenic），均预测该变异致病。Cys254预测与Cys238形成二硫键，该键位于催化三联体His253、Asp302和Ser404附近；AlphaFold2预测的三级结构中相关残基具有高或很高置信度。
（3）体外分泌分析：HEK293T细胞表达FVII-GFP、FVIIp.Cys254Arg-GFP、未标记FVII及FVIIp.Cys254Arg后，Western blot显示GFP标记突变体胞内水平仅轻微但显著降低；野生型FVII可在上清中检出，而突变体分泌显著受损，GFP标记变异分泌平均降低超过97%，未标记变异降低超过95%；FVII-HA及FVIIp.Cys254Arg-HA呈相似趋势，但HA标记蛋白总体丰度较低，突变体-HA分泌降低约86%。HiBiT生物发光定量显示FVIIp.Cys254Arg-HiBiT分泌较野生型FVII-HiBiT降低超过95%。上述结果共同表明p.Cys254Arg导致FVII分泌缺陷。
（4）亚细胞定位分析：共聚焦激光扫描显微镜显示，FVII-GFP与FVIIp.Cys254Arg-GFP均部分共定位于ER标记；二者均未显示与Golgi标记的可检测共定位，且两变体胞内定位无明显差异。野生型FVII-GFP虽经Western blot和生物发光定量证实可分泌，但未显示明显Golgi共定位；原文讨论提出可能与COPII（外壳蛋白复合物II）囊泡运输容量有限及过表达造成的瓶颈等有关，并指出既往研究对FVII与Golgi共定位的报道并不一致。该结果不改变p.Cys254Arg导致分泌缺陷的主要结论。
五、讨论与结论
讨论指出，此前p.Cys254Arg患者及p.Cys254Tyr患者均伴有其他F7变异，难以单独评估该位点影响；该研究报道的病例（儿子）携带p.Cys254Arg而无额外复合杂合变异，从而确认其致病性。父亲额外的p.Arg413Gln已知可导致FVII:Ag降低约20–25%并伴FVII:C降低，但鉴于p.Cys254Arg造成严重分泌缺陷，父亲FVII缺陷主要由p.Cys254Arg引起，p.Arg413Gln影响相对边缘。父子FVII:C和FVII:Ag均低于正常50%，超过杂合致病变异的一般预期，因此不能排除p.Cys254Arg的显性负效应，但原文指出尚需适当实验确定。父子均无临床显著出血，ISTH/SSC出血评估工具评分为0，符合FVII缺陷临床表型异质性大、残余FVII:C与症状严重程度无直接相关性的现象。Cys238-Cys254二硫键高度保守，p.Cys254Arg破坏该键，可能导致错误折叠或游离硫醇暴露，继而经ER相关降解（ERAD）在胞内降解而非分泌；这与Cys238Tyr患者FVII:C约30%、FVII:Ag约37%以及Cys238Phe纯合患者FVII:Ag低于检测限而残余FVII:C为1.3%等报道一致。原文未测定重组FVIIp.Cys254Arg酶活性，但作者依据既往二硫键破坏结果假设可能存在低水平残余活性。蛋白酶结构域中影响分泌的FVII变异可表现为合成率降低和ER滞留，并与ER应激及未折叠蛋白反应（UPR）相关；其他凝血因子变异亦可增强胞内降解，这可能解释GFP标记突变体胞内显著减少。共聚焦中部分ER共定位支持重组蛋白成功翻译；野生型FVII-GFP缺乏可检测Golgi共定位的原因尚待未来研究，但最重要结论是p.Cys254Arg基于分泌缺陷导致遗传性I型FVII缺陷。研究结论翻译：在此，研究人员在体外表征FVIIp.Cys254Arg变异的致病性，该变异由c.760T>C突变引起。该F7突变在父亲和儿子中呈杂合状态，二者均表现FVII:C和FVII:Ag显著降低。活性与抗原水平降低由FVIIp.Cys254Arg变异分泌严重受损导致。总之，F7点突变c.760T>C是遗传性FVII I型缺陷的致病原因。