双特异性GPVI/CLEC-2纳米抗体配体激活血小板的价数依赖性与单价纳米抗体的差异性抑制

《Thrombosis Research》：Differential inhibition of bispecific GPVI and CLEC-2 nanobody ligands by a monovalent nanobody

　　

研究人员前期已表征一系列针对血小板受体GPVI（glycoprotein VI，糖蛋白VI）和CLEC-2（C-type lectin-like receptor 2，C型凝集素样受体2）的单特异性多价纳米抗体（nanobody, Nb）（Nb2和Nb4），结果表明三价和四价纳米抗体可诱导强效血小板聚集。在本研究中，研究人员构建了一系列针对GPVI和CLEC-2的二价、三价和四价双特异性纳米抗体，以模拟柴油机尾气颗粒（diesel exhaust particles）和多硫酸化糖聚合物（polysulphated glycopolymers）等可交联两种受体的配体。与二价单特异性纳米抗体的结果相反，双特异性二价纳米抗体Nb2:Nb4在多数供体中刺激弱聚集，部分供体在10分钟过程中达到最大聚集。三价纳米抗体Nb2-2:Nb4（含两个GPVI纳米抗体拷贝）和Nb2:Nb4‐2（含两个CLEC-2纳米抗体拷贝）以及四价纳米抗体Nb2-2:Nb4-2在所有供体中刺激完全聚集。三价纳米抗体诱导的激活可被Src和Syk酪氨酸激酶抑制剂（Src and Syk tyrosine kinase inhibitors）阻断。Nb2（100 nM）是针对单特异性四价纳米抗体Nb2-4的竞争性拮抗剂。在该浓度下，Nb2对Nb2:Nb4-2反应的影响可忽略，但将Nb2-2:Nb4的浓度-反应曲线转变为钟形。采用平衡质量作用（equilibrium mass action）对由两种不同表位组成的三价双特异性配体的相互作用进行建模，也预测了差异性效应。这些结果对抑制交联一种以上受体的配体具有重要意义。

Vairavan N. Gopalan、Steve P. Watson、Lloyd J. Bridge和Eleyna M. Martin围绕血小板主要刺激型糖蛋白受体GPVI（glycoprotein VI，糖蛋白VI）、CLEC-2（C-type lectin-like receptor 2，C型凝集素样受体2）、FcγRIIA（低亲和力免疫球蛋白γ Fc区受体II-a）和PEAR1（platelet endothelial aggregation receptor 1，血小板内皮聚集受体1）的交联激活开展研究。上述受体为单次跨膜蛋白，GPVI经盐桥与FcRγ（Fc受体γ链）二聚体结合；交联使膜内侧酪氨酸基序达到临界密度，供Src（Src tyrosine kinase，Src酪氨酸激酶）和/或Syk（spleen tyrosine kinase，脾酪氨酸激酶）磷酸化。GPVI、CLEC-2和FcγRIIA经保守YxxL序列信号；FcRγ和FcγRIIA含串联YxxL即ITAM（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，免疫受体酪氨酸基激活基序），CLEC-2含单个YxxL即hemITAM；磷酸化酪氨酸结合Syk的串联SH₂结构域并激活PLCγ₂（phospholipase Cγ₂，磷脂酶Cγ₂）。PEAR1经单个YxxM信号，PI3K（phosphoinositide 3-kinase，磷脂酰肌醇3-激酶）的SH₂结构域交联两个受体并激活Akt。研究人员前期获得针对受体胞外域的高亲和纳米抗体（nanobody, Nb），用（G₄S）₃连接肽制备多价单特异性配体；二价GPVI和CLEC-2纳米抗体在人血小板为拮抗剂，三价低纳摩尔浓度诱导所有供体完全聚集，四价对FcγRIIA激活必要但敏感性较低，四价GPVI、CLEC-2和PEAR1较三价更强，反应依赖受体密度。研究人员提出这些受体作为模式识别受体，配体共性为多价；部分配体交联一种以上受体，如柴油机尾气颗粒和多硫酸化糖聚合物、岩藻聚糖、硫酸葡聚糖交联GPVI和CLEC-2，肝素/抗PF₄（platelet factor 4，血小板因子4）免疫复合物交联FcγRIIA和PEAR1。问题在于如何最优抑制交联多种受体的配体，以及单价纳米抗体对双特异性配体的抑制是否不同。为此，研究人员构建基于Nb2和Nb4的双特异性纳米抗体，研究其激活血小板及在单价对应物存在下的反应，并用平衡质量作用（equilibrium mass action）模型分析，得出双特异性二价弱激活、三/四价强激活，单价Nb2对两种三价双特异性配体呈差异性抑制；这对抑制交联多受体配体具有重要意义。

关键技术方法：构建Nb2（GPVI）与Nb4（CLEC-2）经15氨基酸（G₄S）₃连接的双特异性纳米抗体；二价在细菌表达，三/四价在人胚肾HEK293T细胞表达，多步亲和纯化，SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析纯度；SPR（surface plasmon resonance，表面等离子共振）测定K_D；健康志愿者静脉采血（伯明翰大学内部伦理审查ERN_11-0175，遵循Helsinki宣言）制备洗涤血小板和PRP（platelet-rich plasma，富血小板血浆）；LTA（light transmission aggregometry，光透射聚集测定）记录10分钟聚集；免疫印迹检测全细胞酪氨酸磷酸化及Syk Tyr^525/526、PLCγ₂ Tyr¹²¹⁷；使用Src/Syk抑制剂及ADP（adenosine diphosphate，二磷酸腺苷）/TXA₂（thromboxane A₂，血栓烷A₂）反馈通路抑制剂；采用平衡质量作用模型模拟单价拮抗剂与三价双特异性配体竞争。

3.1 Expression and characterisation of bispecific nanobodies（双特异性纳米抗体的表达与表征）：通过SDS-PAGE分析纯度，通过SPR测定Nb2:Nb4对重组GPVI的K_D为0.30±0.01 nM、对CLEC-2为170±19 nM，与亲本Nb2（0.58±0.06 nM）和Nb4（137±7 nM）无显著差异，结论是连接不干扰受体结合。

3.2 Nb2:Nb4 stimulates delayed aggregation in a subset of donors（Nb2:Nb4在部分供体中刺激延迟聚集）：通过LTA发现二价双特异性Nb2:Nb4在多数供体引起弱、起效慢的聚集，10名中2名达最大，阈值10 nM；eptifibatide抑制聚集，说明由整合素α_IIbβ₃介导的真聚集；PRP中6名中4名达最大；无反应供体中Nb2:Nb4（100、1000 nM）抑制GPVI激动剂Nb2-3和CLEC-2激动剂Nb4-3诱导的聚集，且抑制程度有差异。结论：与二价单特异性拮抗不同，二价双特异性为弱激动。

3.3 Trivalent and tetravalent bispecific nanobodies to GPVI and CLEC-2 stimulate rapid platelet activation（GPVI/CLEC-2三价和四价双特异性纳米抗体快速激活血小板）：通过LTA发现Nb2-2:Nb4、Nb2:Nb4-2和Nb2-2:Nb4-2在10 nM使所有供体快速完全聚集，部分供体阈值3 nM；通过免疫印迹发现两株三价双特异性纳米抗体快速持续增加全细胞酪氨酸磷酸化及Syk Tyr^525/526、PLCγ₂ Tyr¹²¹⁷磷酸化，dasatinib和PRT-060318阻断或部分降低；聚集被dasatinib、PRT-060318阻断，被ticagrelor和indomethacin单独或联合部分降低，并被eptifibatide抑制。结论：经ITAM依赖通路激活，ADP和TXA₂反馈增强，整合素介导聚集。

3.4 Nb2 inhibits platelet aggregation by Nb2-2:Nb4（Nb2抑制Nb2-2:Nb4诱导的血小板聚集）：通过LTA发现Nb2（100 nM）对Nb2:Nb4-2的聚集幅度无显著影响，而将Nb2-2:Nb4的浓度-反应曲线转为钟形；Nb4-2不能诱导显著聚集；平衡质量作用建模预测单价拮抗剂对含一个或两个竞争表位的三价双特异性配体呈配体特异性抑制。结论：单价Nb2对两种三价双特异性配体存在差异性抑制，亲合力可克服竞争。

讨论部分总结：原文指出双特异性二价弱激活而三/四价强激活；单价Nb2差异性抑制三价双特异性，Nb2对Nb2:Nb4-2影响可忽略，对Nb2-2:Nb4呈钟形，反映受体占据竞争，建模预测一致。原文提出二价双特异性弱激活可能与GPVI-CLEC-2交联形成更多受体复合物或CLEC-2 hemITAM交联形成大复合物有关；无反应供体可能与一种或两种受体表达水平差异有关，这与二价CLEC-2纳米抗体在低表达时拮抗、高表达时激动一致。钟形曲线与多价配体受体聚集的预测一致；Nb2对含两个CLEC-2拷贝的三价配体抑制可忽略，强调亲合力克服拮抗剂竞争。原文认为这对靶向通过聚集信号且结合多种表面受体的配体有启示；胶原结合GPVI和整合素α₂β₁，纤维蛋白结合GPVI和α_IIbβ₃，vWF（von Willebrand factor，血管性血友病因子）结合GPIb和α_IIbβ₃，可解释阻断纳米抗体对胶原的活性较仅结合GPVI的CRP（collagen-related peptide，胶原相关肽）弱10–100倍。限制包括：纳米抗体为合成配体、表位少，模拟内源配体程度不清；建模假设配体参与由受体交联介导，未纳入亲和动力学、受体同源二聚化、磷酸化胞质尾交联及ITAM/hemITAM组织等；双特异性配体结合具随机性且受体密度高，单分子定位难解析单个复合物。

研究结论部分翻译：总之，本研究报道单价拮抗剂对表位数目不同的双特异性配体具有差异性抑制作用。这对以结合一种以上受体的激动剂最优抑制受体具有重要意义。例如，考虑到胶原在血小板表面结合GPVI和整合素α₂β₁，这可能是GPVI拮抗剂glenzocimab在缺血性卒中中疗效相对较弱的一个促成因素。