纸基集成适配体–CRISPR/Cas12a传感平台（PACSense）实现低成本装置内多重小分子即时检测

《RSC Advances》：Paper integrated aptamer–CRISPR sensing enables multiplexed small-molecule sensing in a low-cost deviceOpen Access

基于CRISPR/Cas12a的诊断已实现核酸检测的阿摩尔（aM）级灵敏度，但其向小分子靶标的拓展仍受限于溶液相适配体传感器–CRISPR偶联需求以及与资源有限环境不相容的实验室基础设施。此处，研究人员报告了一种纸基集成适配体–Cas12a传感平台（Paper-integrated Aptamer–Cas12a Sensing platform，PACSense），其中完整的适配体传感器–CRISPR/Cas12a信号转导级联被空气干燥于纸基底内，从而形成仅由加样即可启动的一锅式、无扩增小分子检测工作流。研究展示了两种正交传感模式：第一，针对腺苷5′-三磷酸（ATP）的信号关闭型双价适配体通道，溶液相和纸相检测限（LOD）分别为336 nM和446 nM；第二，针对可卡因的信号开启型互补链置换通道，据研究人员所知，这代表NC195适配体首次与CRISPR/Cas12a传感偶联，其溶液相和纸相LOD分别为0.605 μM和16.15 μM。两个通道在单个多重纸芯片上同时运行，交叉通道几何结构将样本被动引导至四个空间上不同的反应区，并在495 nm蓝光LED下通过荧光成像确认独立且同时检测。空气干燥芯片在无冷链室温储存30天后保留初始荧光信号的76%，从功能平衡基线计则测得93%的信号保留。完整检测工作流在20分钟内完成，使用可重复使用的醋酸钠暖手器进行孵育，并使用3D打印的智能手机兼容读取器，设计上符合即时诊断（POC）的ASSURED标准。PACSense确立了纸基集成适配体传感器–CRISPR传感作为在需求点实现多重、无需实验室仪器的小分子诊断的可行途径。

研究背景方面，全球健康中快速、可负担诊断的公平可及仍是关键未满足需求，世界卫生组织ASSURED框架为即时诊断（point-of-care，POC）提供了可负担、灵敏、特异、用户友好、快速稳健、无需设备和可送达终端用户的基准。纸基微流控（paper-based microfluidics）因被动毛细流、空气干燥试剂储存和低成本制造而具吸引力，但传统侧向流分析多依赖抗体，主要限于蛋白或病原靶标；拓展至代谢物、药物滥用和环境污染物等小分子，需要能以高亲和力和构象选择性识别低分子量靶标的生物受体。适配体（aptamer，可结合特定靶标的单链寡核苷酸）可通过SELEX筛选获得，热稳定性好，并在靶标结合时发生构象切换，但直接适配体读出缺乏内在扩增，灵敏度受适配体亲和力限制。CRISPR/Cas12a在识别双链DNA激活物后可非特异切割单链DNA，实现催化放大；然而Cas12a需要核酸激活物，小分子检测必须借助适配体–CRISPR分子接口。已有适配体–CRISPR小分子传感器均在溶液相运行，需要移液、试管和热循环仪或水浴，不适应资源有限环境；空气干燥CRISPR试剂虽已用于纸基核酸检测，但小分子检测要求适配体在纸上保持构象切换，并克服纤维素吸附、扩散受限和离子微环境改变。此前尚无工作证明从分子结合、适配体构象切换到Cas12a激活的完整级联在纸基底内端到端运行。因此，研究人员开展PACSense研究，将完整适配体–CRISPR/Cas12a级联空气干燥于纸内，以ATP和可卡因为概念验证靶标，展示一锅式、无扩增、多重和无需实验室仪器的检测，并评估灵敏度、选择性、储存稳定性和便携读取器。其重要意义在于将CRISPR小分子诊断推向符合ASSURED的POC格式，并证明纸基集成适配体传感器–CRISPR传感可作为多重小分子诊断的可行路线。

关键技术方法（≤250字）：研究人员采用激光切割Whatman 113色谱纸构建单区芯片及三层四反应区多重纸芯片；将适配体、Cas12a–crRNA和报告探针以10×浓度空气干燥，使用聚乙烯醇（PVA）作为稳定剂，Mg²⁺在复水时经结合缓冲液引入；在溶液相和纸相进行一锅式适配体–CRISPR/Cas12a反应，以荧光图像和ImageJ定量，LOD按3σ/slope计算；以可重复使用醋酸钠暖手器提供37–45 °C孵育，以3D打印外壳、495 nm蓝光LED、橙色丙烯酸发射滤光片和智能手机成像构成便携读取器。本文未涉及临床样本队列。

研究结果：3.1 传感器设计与工作原理：研究人员设计ATP信号关闭型双价适配体通道和可卡因信号开启型NC195链置换通道，并将适配体与CRISPR试剂空气干燥于纸内，配合三层多重芯片、暖手器和3D打印读取器；结果表明加样即可启动一锅式检测，荧光可在5–10分钟内出现。3.2 ATP适配体传感器–CRISPR系统的溶液相表征：在0–5000 μM ATP下观察到信号关闭型剂量响应，0–500 μM线性R²=0.95，LOD为336 nM；说明双价适配体–Cas12a偶联在溶液相有效，且Cas12a催化放大使检测低于表观适配体解离常数（K_d）。3.3 纸基ATP检测及分析性能：通过10×试剂、复水引入Mg²⁺和PVA稳定化，纸芯片呈0–5000 μM信号关闭响应，0–200 μM线性R²=0.92，LOD为446 nM，仅较溶液相升高1.3倍；证明完整级联可在纸内无溶液相预孵育运行。3.4 ATP适配体选择性：在溶液相以GTP和AMP各1000 μM测试，仅ATP 500 μM显著抑制荧光，纸上GTP和AMP亦无明显信号降低；表明选择性在一锅CRISPR和纸基复水后保持。3.5 可卡因概念验证及信号开启传感器整合：研究人员将NC195与20个核苷酸激活链结合，0–500 μM可卡因呈信号开启响应，0–100 μM线性R²=0.92，溶液相LOD为0.605 μM；据研究人员所知，这是NC195首次与CRISPR/Cas12a传感偶联，并提示该通道灵敏度可能受激活链置换热力学而非适配体亲和力限制（作者提出，未实验证实）。3.6 纸基可卡因检测及分析性能：空气干燥纸芯片呈0–500 μM信号开启响应，0–80 μM线性R²=0.95，纸相LOD为16.15 μM，较溶液相约高27倍；作者将其归因于纸基质中竞争性链置换平衡受限。3.7 集成纸芯片上的多重同时检测：染料试验显示中心入口向四区对称同时毛细流动；混合500 μM ATP和500 μM可卡因时，可卡因信号开启区和阳性对照区发亮，ATP信号关闭区与阴性对照无统计学差异，单因素方差分析显示区间显著差异；证明双通道可在单芯片同时运行，但仅为单一浓度组合的概念验证。3.8 室温储存条件下试剂稳定性：30天室温干燥储存呈双相衰减，前4天下降约18%，第20天维持80–83%，第30天为76%；以第4天功能平衡基线计保留93%，但未评估储存后校准和LOD。3.9 原型读取器与实验室透射仪比较：在空白和500 μM ATP条件下，原型读取器与透射仪均能正确区分阴阳性，信噪比分别为2.2×和2.4×；但未证明二者在定量灵敏度、线性、选择性和长期稳定性上的等效性。

讨论部分总结：作者指出本研究为概念验证，局限包括可卡因通道未评估纸相选择性和复杂生物/法医基质验证；多重检测仅在500 μM ATP与500 μM可卡因单一高浓度组合下演示，未开展全分析范围交叉干扰；30天储存研究仅跟踪荧光信号，未复测储存后分析性能，且稳定性芯片来自单一批次；3D打印读取器仅与透射仪在空白和500 μM ATP条件下比较；可卡因纸相LOD较高的机制未通过改变激活链长度、熔解温度或置换平衡进行实验剖析。研究结论翻译：研究人员提出了PACSense，一种纸基集成适配体–Cas12a传感平台，据研究人员所知首次证明完整适配体传感器–CRISPR信号转导级联在空气干燥纸基质内端到端运行且无需溶液相预孵育。以ATP和可卡因为概念验证小分子，平台溶液相LOD分别为336 nM和0.60 μM，纸相LOD分别为ATP 446 nM和可卡因16.15 μM。同一平台架构实现两种正交传感模式：针对ATP的信号关闭型双价适配体通道，改编Li et al.策略；针对可卡因的信号开启型互补链置换通道，据研究人员所知为NC195适配体首次与CRISPR/Cas12a传感偶联。ATP传感器在其表观适配体K_d（12.6 μM）以下工作，研究人员将其解释为Cas12a催化放大将检测延伸至表观亲和力极限以下，同时指出占据、动力学、平衡和放大仍相互关联；可卡因传感器在NC195的K_d（39 nM）以上工作，作者提出这反映竞争性链置换架构，其中置换平衡而非适配体可能成为灵敏度限制步骤。这些观察提示适配体–CRISPR偶联设计考虑：直接隔离激活物的信号关闭架构似乎可利用Cas12a的全部放大收益，而信号开启置换架构可能需要激活物双链与靶标–适配体相互作用在热力学上匹配，才能充分利用受体亲和力。两个通道在单一多重纸芯片上同时运行，在测试的单一浓度组合下于495 nm LED照明下实现独立检测和清晰视觉区分。从诊断工程角度，PACSense解决了CRISPR小分子传感现场部署的若干实际障碍：PVA稳定的完整试剂组件空气干燥于Whatman 113色谱纸内，支持室温储存，30天信号保留76%，从第4天功能平衡基线计保留93%，降低冷链需求；可重复使用醋酸钠暖手器替代热循环仪或水浴；带橙色丙烯酸发射滤光片的3D打印外壳实现智能手机荧光读取，与实验室透射仪比较在测试条件下阴阳性判别一致；从加样到读取的完整工作流在20分钟内完成，并设计符合资源有限环境POC诊断的ASSURED标准。当前工作确立PACSense平台架构的概念验证，并指出进一步开发方向：可卡因适配体传感器通道仍需纸相选择性表征和相关生物或法医样本真实基质测试；优化NC195激活链长度和熔解温度有望提高可卡因检测灵敏度；将平台扩展至临床、环境或食品安全相关小分子靶标可进一步展示适配体传感器–CRISPR偶联策略的模块性；将定量图像分析整合入智能手机应用，可提供适用于无实验室支持的社区健康工作者和现场响应人员的完全自包含诊断工具。