小鼠脊髓损伤（SCI）中小胶质细胞标记的时机、效能与特异性：从稳态标志物到反应性表型的批判性评述

《GLIA》：Microglial Labeling in Mouse Spinal Cord Injury: A Review of Timing, Efficacy, and Specificity

创伤性脊髓损伤（SCI）是一种复杂且致残性疾病，目前尚无治愈性疗法。原发性损伤阶段的机械性损伤之后，继发性损伤阶段会释放自由基和促炎细胞因子，导致慢性炎症，从而加重损伤。小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的驻留免疫细胞，在协调该炎症反应中发挥关键作用。研究SCI后小胶质细胞的动态变化，不仅可加深对损伤病理学的理解，也可推动针对小胶质细胞的免疫疗法开发。然而，创伤诱导的转录和表型变化意味着用于识别稳态小胶质细胞的标志物在应用于其反应性对应细胞时可能不可靠。另一主要挑战在于区分驻留小胶质细胞与损伤后穿过血脊髓屏障（BSCB）的浸润性单核细胞来源巨噬细胞（MDM）。在本综述中，研究人员考察选择合适小鼠小胶质细胞标记策略的三个关键变量：（i）时间（相对于损伤）；（ii）效能（在所选择的小鼠SCI模型内）；以及（iii）特异性（对小胶质细胞）。研究人员讨论小鼠小胶质细胞损伤前转录景观及其损伤后改变，评估常用标志物的优势与局限，并重点介绍用于临床前小鼠SCI研究中小胶质细胞研究的新兴工具和方法。

1 Introduction
1.1 Pathophysiology of Spinal Cord Injury (SCI)
创伤性脊髓损伤（SCI）具有高致残率且治疗选择有限，其病理生理可分为原发性与继发性损伤阶段。原发性损伤由压迫、横断或挫伤等物理创伤直接造成，伴随局部血管损伤、血脊髓屏障（BSCB）破坏、神经元与胶质细胞死亡及脱髓鞘。继发性损伤进一步分为急性（<48 h）、亚急性（48 h至2周）、亚慢性（2周至6个月）和慢性（>6个月）阶段，涉及缺血、兴奋性毒性、氧化应激、凋亡信号、沃勒变性以及由反应性星形胶质细胞和硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）参与的胶质瘢痕形成，Nogo-A和髓鞘相关糖蛋白等亦构成再生抑制信号。炎症贯穿继发性损伤，主要由CNS驻留小胶质细胞和跨BSCB浸润的MDM驱动，既通过细胞因子和趋化因子加重组织损伤，也通过吞噬和清除细胞碎片发挥有益作用；持续性神经炎症可转为适应不良并损害恢复，因此小胶质细胞是理解SCI病理机制和开发免疫疗法的重要靶点。

1.2 The Nomenclature of Microglia in SCI
小胶质细胞是CNS实质的驻留免疫细胞，与MDM在功能、形态和表面标志物上存在重叠，但二者起源不同：小胶质细胞来源于胚胎卵黄囊并依靠局部增殖维持，MDM来源于骨髓单核细胞。小胶质细胞参与固有免疫、吞噬、分泌以及神经发生、血管发生、髓鞘形成和突触重塑等过程。“静息/激活”及“M1/M2”二分法已不再被广泛接受，健康CNS中的小胶质细胞应称为“稳态”细胞，病理状态下则变为“反应性”细胞并发生功能、转录、代谢和形态改变。单细胞转录组学显示反应性小胶质细胞并非两种离散状态，而是随疾病背景、区域和时间形成连续状态，如疾病相关小胶质细胞（DAM）和SCI中的损伤激活小胶质细胞与巨噬细胞（IAM）表型，因此SCI研究应重视其多维状态。

1.3 Studying Microglia in SCI
SCI后小胶质细胞的转录等 profile 会随损伤环境改变，一些“激活标志物”上调，而许多稳态标志物下调；同时，许多常用小胶质细胞标志物也表达于MDM和CNS相关巨噬细胞（CAM），包括血管周、软脑膜和脉络丛巨噬细胞。健康CNS中缺乏外周MDM，因此共享标志物主要标记小胶质细胞及可能的CAM；SCI后MDM跨受损BSCB进入CNS，标记复杂性显著增加。本综述聚焦临床前小鼠SCI研究中的小胶质细胞标记，按时间（损伤前、急性、亚急性、亚慢性和慢性）、效能（小鼠损伤模型）和特异性（对小胶质细胞）评估标志物，并将“microglia-specific”定义为在CNS实质仅由小胶质细胞表达且在外周不表达于单核细胞或MDM的基因。

2 Homeostatic Microglial Markers and Experimental Approaches to Study Labeled Microglia in the Mouse
2.1 Early Microglial Studies Using 2D Microscopy and Flow Cytometry
小胶质细胞最早由Río-Hortega描述，早期免疫组织化学（IHC）借助F4/80、Cd68和Cd11b等巨噬细胞标志物进行可视化。IHC结合共聚焦或类似二维显微镜仍是常用且可及的方法，F4/80（Adgre1/Emr1）和Cd68仍广泛用于IHC；Cd11b（Itgam）常与Cd45（Ptprc）联合用于流式细胞术，小胶质细胞表现为Cd11b⁺Cd45^lo，MDM表现为Cd11b⁺Cd45^hi。Iba1（Aif1）是原型小胶质细胞抗体标志物，在啮齿类脑内特异表达于小胶质细胞及CAM，但也表达于外周MDM；Cx3cr1、Csf1r、P2ry12等随后被鉴定。荧光激活细胞分选（FACS）或磁激活细胞分选（MACS）常基于Cd11b⁺Cd45^lo分选小胶质细胞以进行转录组研究。

2.2 Microglial Profiling With Advances in Microarray and Next-Generation Sequencing (NGS)
基因芯片和下一代测序（NGS）推动了对小胶质细胞转录特征的解析。早期基因阵列鉴定出F11r、Gpr12（P2ry12）、Gpr34和Msr2（Fcrls）等小胶质细胞优势表达基因；ImmGen项目显示小胶质细胞低表达多种其他巨噬细胞基因，富集Cx3cr1、Fcrls、Gpr84、Hexb、Olfml3、Sall1、Serpine2、Siglech、Slc2a5、Sparc、Tmem119和Trem2等。后续研究提出106基因小胶质细胞signature，核心包括C1qa、C1qb、Csf1r、Ctss、Cx3cr1、Gpr34、Hexb、Mafb、Olfml3、P2ry12、P2ry13和Tmem119；另一研究定义65个跨发育和成年保守的稳态标志物，其中14个为微胶质特异。单细胞RNA测序（RNA-seq）进一步描述健康小胶质细胞高表达Cst3、Selplg、Slc2a5、Sparc和Tmem119等，并提出12标志物panel区分小胶质细胞、CAM、单核来源细胞和树突状细胞。Hickman等提出小胶质细胞“sensome”，包括模式识别受体、细胞因子/趋化因子受体、细胞外基质受体和嘌呤能受体等。未损伤脊髓中的稳态cluster由Aif1、Btg2、C1qb、Csf1r、Cst3、Cx3cr1、Egr1、Egr3、Fcrls、Fos、Gpr34、Hexb、Hspa1a、Itgb5、Jun、Klf2、Mertk、Olfml3、P2ry12、P2ry13、Plxdc2、Ptprc、Rnase4、Sall1、Selplg、Serpine2、Siglech、Slc2a5、Sparc、Tgfbr1和Tmem119等基因界定。

2.3 3D Microscopy Applications for the Study of Spinal Microglia In Vivo
三维显微镜需借助报告小鼠进行活体成像。Cx3cr1^GFP报告小鼠首次实现小胶质细胞活体成像；脊髓成像受心跳和呼吸运动伪影限制，需定制稳定装置和深麻醉，或在麻痹并人工通气条件下进行。骨髓嵌合体可利用小胶质细胞与单核细胞对辐射敏感性差异区分二者；组织透明化结合双光子显微镜可在横断模型中评估病灶内小胶质细胞密度和形态。Hexb^tdTomato和Tmem119^tdTomato报告小鼠适用于颅窗活体双光子成像；多报告基因小鼠可研究驻留与浸润髓系细胞及轴突相互作用。植入腔可实现慢性纵向成像，但手术暴露本身可能诱导炎症；椎间窗等微创设计可减少炎症，清醒小鼠长期成像需运动校正和工作流程优化。

3 Microglial Markers and Tools in the Context of SCI
3.1 The Transcriptional Profile of Microglia After SCI
SCI后稳态cluster被损伤相关cluster替代，急、亚急和亚慢性/慢性阶段存在大量差异表达基因，并与DAM表型显著重叠。损伤后小胶质细胞可表达Abca1、Apoe、Axl、Cd9、Csf1、Gfap、Gpnmb、Igf1、Il1b、Itgax、Lgals3、Lpl、Lyz2、Mmp12、Msr1、Spp1、Stat1、Tlr2和Vim等，但这些并非微胶质特异，Gfap和Itgax甚至是其他细胞标志，需与Iba1等建立的小胶质细胞标志联合使用。部分标志物上调或稳定（如C1qa、Clec7a、Cst7、Ctsd、S100a8、Trem2以及Cd45、Cd68、F4/80、Iba1），而稳态标志物如Cx3cr1、P2ry12、P2ry13、Selplg、Siglech、Tgfbr1和Tmem119下调；慢性期小胶质细胞仍参与胶质瘢痕边界和慢性疼痛维持，因此工具验证不应假定急/亚急性期可靠的工具在慢性期同样可靠。

3.2 Aif1/Iba1: Anti-Iba1, Iba1^EGFP
Iba1是IHC可视化小胶质细胞的原型标志物，但在外周浸润情境下也表达于MDM，并标记CAM，因此非微胶质特异。其优势在于反应性小胶质细胞中表达稳健，在临床前SCI中报道稳定，并在多种CNS损伤/疾病模型中上调。Iba1^EGFP报告小鼠可实现活体标记，EGFP⁺细胞呈分枝状且Iba1⁺；总体而言，Iba1可稳健标记SCI病灶小胶质细胞，但也会标记浸润MDM和CAM。

3.3 Csf1r: Anti-Csf1r/Anti-Cd115, Csf1r^EGFP, ΔCsf1r^ECFP, Csf1r^mApple, and Csf1r^FRed
Csf1r表达于单核吞噬细胞系统（MPS）包括小胶质细胞、单核细胞、组织驻留巨噬细胞和经典树突状细胞。抗Csf1r（抗Cd115）抗体因受体结合后内吞和降解导致膜表达不可靠；SCI中Csf1r表达报道不一，且相关报告鼠尚未在SCI环境充分测试。Csf1r^EGFP“MacGreen”标记小胶质细胞和CAM，也标记外周MDM和血单核细胞，标记效率高；ΔCsf1r^ECFP“MacBlue”靶向MPS亚群但小胶质细胞标记效率低于MacGreen；Csf1r^mApple与MacGreen一致，Csf1r^FRed可标记小胶质细胞、CAM、MDM和血单核细胞。总体而言，Csf1r工具会标记至少部分单核/巨噬细胞群体，SCI中的效能尚未确定。

3.4 Cx3cr1: Anti-Cx3cr1, Cx3cr1^GFP, Cx3cr1^Cre, and Cx3cr1^CreER
Cx3cr1在CNS中由小胶质细胞和CAM表达，外周单核细胞、MDM和树突状细胞亦表达。Cx3cr1^GFP首次实现小胶质细胞活体研究，但为敲除设计，需杂合繁育以保留一个功能等位基因。Cx3cr1^Cre和Cx3cr1^CreER结合R26^yfp显示高重组和CNS内高特异性，但血单核细胞亦表达YFP；CreER可利用MDM更新快的特点，通过提前数周给予他莫昔芬区分长寿命小胶质细胞与短寿命MDM。SCI中Cx3cr1常下调，但Cx3cr1^GFP/+和Cx3cr1^CreERT2R26^tdT仍用于分选小胶质细胞。Cx3cr1工具交叉验证最充分，但共享表达和敲除设计限制其特异性与功能干扰。

3.5 Fcrls: Fcrls^Cre
Fcrls是微胶质特异基因，功能未明；抗Fcrls抗体尚未用于小胶质细胞IHC。Fcrls^Cre为组成型工具，无需他莫昔芬，流式显示对Cd45⁺白细胞包括单核细胞几乎无Cre活性，与多种报告等位基因杂交可实现高效特异的小胶质细胞靶向；CAM也表达Fcrls并被靶向，脾和肝巨噬细胞有轻度标记。其优势是保留Fcrls mRNA表达；局限是SCI中有效性未定，且有在SCI和其他CNS损伤/疾病模型中下调的报道。

3.6 Hexb: Hexb^tdTomato, Hexb^CreERT2
Hexb在微胶质特异基因中表达最高，且在临床前SCI和DAM表型中稳定。Hexb^tdTomato和Hexb^CreERT2分别用于可视化和靶向小胶质细胞；Hexb^tdTomato在脊髓组织中高效特异，几乎全部Iba1⁺细胞为tdT⁺，CAM标记很低，外周仅部分肾巨噬细胞标记，并已在临床前SCI中有效使用。Hexb^CreERT2经FACS和组织学验证具有高重组和特异性，CAM靶向极少，并可选择性耗竭小胶质细胞而不影响CAM。纯合Hexb^tdT/tdT可降低Hexb mRNA，Hexb^{CreERT2/CreERT2}可降低酶活性，但未发现细胞表型受影响。因此Hexb因稳定性和细胞特异性适合SCI小胶质细胞标记与靶向。

3.7 P2ry12: Anti-P2ry12, P2ry12^CreER
P2ry12为微胶质特异且高表达标志物，抗P2ry12可与Cx3cr1^EGFP及抗Cd11b共定位，但激活后免疫反应性下调；临床前SCI中P2ry12常为最显著下调基因之一。P2ry12^CreER结合Rosa26Ai14显示高重组和特异性，脊髓组织中Cd11b⁺CD45^int和Iba1⁺细胞tdT⁺比例高，脉络丛和脑膜巨噬细胞部分标记，脾巨噬细胞中度重组，循环淋巴细胞和单核细胞几乎不标记。提前7天给予他莫昔芬可在缺血或实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中标记小胶质细胞，但重组效率可能降低。该工具在SCI后高选择性标记方面有潜力，但P2ry12下调是限制。

3.8 Sall1: Sall1^GFP, Sall1^CreER
Sall1为微胶质特异基因并调控小胶质细胞转录signature；Sall1^GFP和Sall1^CreER originally用于发育肾脏间充质细胞，后被重新用于小胶质细胞标记和靶向。Sall1^GFP/+在CNS主要限于小胶质细胞，GFP⁺与Iba1⁺共定位，全部Cd11b⁺Cd45^lo小胶质细胞为GFP⁺，CNS外Cd45⁺细胞GFP^?，约5% CAM为GFP⁺；EAE中微胶质保持Sall1⁺而浸润免疫细胞Sall^?。Sall1^CreER可实现>90%重组并靶向小胶质细胞，不标记CAM，但有Cd45^?Cd11b^?CNS细胞异位表达报道。SCI中未报道Sall1下调，DAM中稳定，但EAE和其他CNS病理模型有下调报道；SCI中的工具效能尚未明确，若表达稳定则选择性优于泛巨噬细胞标志。

3.9 Tmem119: Anti-Tmem119, Tmem119^EGFP, Tmem119^CreERT2, and Tmem119^tdTomato
Tmem119为微胶质特异基因，高选择表达于实质小胶质细胞，原位杂交显示CAM和外周Cd45⁺免疫细胞不表达。抗Tmem119在视神经挤压等损伤模型中显示所有Iba1⁺实质细胞双阳性，浸润单核细胞多为Tmem119^?。Tmem119^EGFP、Tmem119^CreERT2和Tmem119^tdTomato均显示高特异和高重组，几乎不标记单核细胞，CAM和少数外周免疫细胞可有少量标记；敲入设计保留内源表达但蛋白水平可能降低。多种CNS损伤/疾病模型中Tmem119显著下调，提示其可能不适合至少急性/亚急性SCI；但有研究用Tmem119^CreER在急性至亚慢性SCI中靶向小胶质细胞。总体而言，Tmem119工具特异性高但SCI中稳定性受限。

3.10 Binary Tools: Cx3cr1^GFPCcr2^RFP, Cx3cr1^ccreSall1^ncre
为克服单启动子工具特异性不足，研究者开发了二元Cre系统。Cx3cr1^GFP/+Ccr2^RFP/+中，健康CNS的GFP与Iba1⁺小胶质细胞共定位而无RFP；EAE中RFP仅出现于Cd45^hi单核细胞而非Cd45^lo小胶质细胞，因此微胶质为Cx3cr1⁺Ccr2^?（绿色），MDM为Cx3cr1⁺Ccr2⁺（绿+红）。该策略已用于临床前SCI，但CCR2RFP下调限制其可靠性。Cx3cr1^ccreSall1^ncreR26^tdT可靶向实质小胶质细胞，tdT⁺细胞为Cd11b⁺Cd45^int，杂合动物重组效率约25%，不标记CAM、血液和外周器官，重组细胞表达典型微胶质基因。二元系统提高选择性，但启动子效率影响标记效率。其他工具还包括抗Anxa3、抗Siglech、抗Cd11b、抗F4/80、抗Apoe、抗Igf1以及Cd68^GFP、Clec7a^CreERT2和Trem2^mKate2等。

4 Discussion
选择SCI小胶质细胞研究工具时，应优先考虑对小胶质细胞的选择性（包括髓系细胞表达和异位表达）以及在SCI模型中的表达稳定性，其次考虑Cre工具重组效率、对內源表达的影响和商业可得性。实验方法也影响工具选择：流式和细胞分选适合抗体标志物，流式和FACS也可用于转基因品系；二维显微镜兼容抗体染色和转基因组织；三维显微镜可活体成像麻醉或清醒小鼠，但需转基因小鼠、多光子显微镜等专业技术和设备。现有工具各有优劣：Iba1工具在反应性小胶质细胞中表达稳健但标记浸润MDM；Cx3cr1工具重组效率高但需杂合繁育以避免敲除，且Cx3cr1缺失可能影响CX3CL1/CX3CR1信号及小胶质细胞功能；P2ry12和Tmem119工具特异性高且保留内源表达，但SCI后显著下调；Csf1r工具标记全部MPS且SCI表达稳定性不一；Sall1工具不标记MDM但有异位表达；Fcrls和Hexb工具为微胶质特异且敲入保留内源表达，Hexb^tdTomato已在损伤组织有效标记，Fcrls工具尚未在SCI中测试。二元工具和多标志物panel可提高特异性，CreER工具可利用小胶质细胞自我更新能力区分长寿命小胶质细胞与短寿命MDM；但启动子下调会同时影响Cre、报告基因和抗体。Cx3cr1工具交叉验证最充分，常作为基准。年龄和性别亦影响小胶质细胞转录和炎症表型，衰老可改变约三分之一转录本及半个sensome，雄雌小胶质细胞在转录组、蛋白组、结构和功能上存在差异，SCI炎症谱随性别和年龄不同，选择标志物时应考虑这些变量。综述讨论的标志物也可用于小鼠诱导多能干细胞（miPSC）来源小胶质细胞、三维CNS类器官和外植体脊髓切片；大鼠和斑马鱼等模型标记策略部分不同，且多数工具几乎仅在小鼠中验证，跨物种尤其是人组织验证不足，Fcrls缺乏已知人同源基因，而抗Tmem119已在人和小鼠中表征。未来需结合空间转录组学、成像质谱流式、电镜和机器学习，并发展微胶质特异正电子发射断层成像等，以实现更精确的小胶质细胞signature识别和患者分层治疗。