NEGR1与mGlu5受体的相互作用影响受体细胞信号转导及正向别构调节剂VU0409551的神经保护效应

《British Journal of Pharmacology》：Interaction with NEGR1 affects mGlu5 cell signalling and the neuroprotection induced by the positive allosteric modulator VU0409551

　　

摘要专业翻译 背景与目的：代谢型谷氨酸受体mGlu5在神经元存活和突触可塑性中发挥重要作用。研究人员及他人已证实mGlu5正向别构调节剂（positive allosteric modulators, PAMs）是偏向性激动剂，能够触发神经保护通路的激活并促进神经元存活。由于mGlu5的偏向性药理学源于药物诱导其与不同蛋白伴侣的相互作用，本研究分析了mGlu5相互作用组（interactome），以鉴定能够调节受体细胞信号转导的新型结合伴侣。 实验方法：为鉴定新的mGlu5结合伴侣，研究人员采用质谱法（mass spectrometry），随后通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）实验，证实了mGlu5与神经元生长调节因子1（neuronal growth regulator 1, NEGR1，一种细胞黏附分子）之间的相互作用。随后，研究人员利用慢病毒转导原代神经元培养物敲低NEGR1表达，评估NEGR1对mGlu5细胞信号转导和细胞分布的影响。此外，通过评估凋亡性细胞死亡和 neurite 变性，研究人员检测了NEGR1是否在mGlu5 PAM VU0409551的神经保护效应中发挥作用。 关键结果：NEGR1与mGlu5之间的相互作用对mGlu5的突触定位及其与Homer的偶联至关重要，从而调节由mGlu5受体激活的细胞信号通路。例如，NEGR1敲低导致mGlu5依赖性ERK1/2激活减弱，以及ARC/ARG3.1和BDNF表达降低。重要的是，NEGR1敲低影响了mGlu5的药理学特性，因为在NEGR1低表达的神经元中未观察到VU0409551的神经保护效应。 结论与意义：这些结果表明，NEGR1对于mGlu5偏向性激活神经保护性细胞信号通路以及VU0409551所触发的神经保护效应至关重要。

论文解读

一、研究背景与科学问题

谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，其受体分为离子型和代谢型两大类。第I组代谢型谷氨酸受体（包括mGlu₅）发挥神经调质作用，影响长时程增强（LTP）、长时程抑制（LTD）和神经元存活等生理过程。mGlu₅受体与Gα_q/11蛋白偶联，主要激活磷脂酶Cβ1，产生二酰甘油和肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3），促进细胞内Ca²⁺释放并激活蛋白激酶C。此外，mGlu₅受体可通过与不同蛋白伴侣（包括Homer蛋白）的相互作用激活其他细胞信号通路。

已有研究表明，mGlu₅正向别构调节剂（PAMs）是偏向性激动剂，能够在不触发经典Gα_q/11/IP3信号和细胞内Ca²⁺释放的情况下，激活ERK和Akt等神经保护性信号通路，从而促进神经元存活。CDPPB和VU0409551等mGlu₅ PAMs可预防神经元死亡、增强神经元存活相关基因的表达、促进树突棘成熟，并改善亨廷顿病小鼠模型的认知缺陷。然而，mGlu₅偏向性信号激活取决于受体可用的蛋白伴侣，目前对蛋白伴侣如何调节mGlu₅受体功能的认识仍存在显著不足。已有研究主要聚焦于mGlu₅与细胞内蛋白的相互作用，忽视了其与细胞外蛋白伴侣的潜在相互作用。因此，本研究旨在通过分析mGlu₅相互作用组，鉴定能够调节受体细胞信号转导的新型结合伴侣，以深入理解mGlu₅偏向性药理学机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用纳米级液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）技术，对mGlu₅^+/+和mGlu₅^?/?小鼠海马裂解物中经抗mGlu₅抗体免疫沉淀的蛋白进行分析，鉴定出21个在野生型小鼠中显著富集的蛋白。通过生成扩展的mGlu₅蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，研究人员发现部分新鉴定的mGlu₅蛋白伴侣与已知受体结合蛋白存在相互作用。过表达分析表明，与mGlu₅相互作用的蛋白参与突触囊泡成熟和神经元稳态等重要生物学过程。除已知的Homer1、G蛋白亚基和mGlu₁外，研究还鉴定出新的mGlu₅蛋白伴侣，包括免疫球蛋白超家族（IgSF）的细胞黏附分子（CAMs），如NEGR1、Thy-1和Contactin-1。

通过免疫共沉淀实验，研究人员在皮层和海马脑裂解物以及原代皮层-纹状体神经元培养物中均证实了mGlu₅与NEGR1的物理相互作用。利用表达GFP标记的慢病毒载体（shNEGR1或shSCR对照）在原代培养神经元中敲低NEGR1表达约75%后，研究发现NEGR1敲低并不改变mGlu₅总蛋白水平或质膜定位，但增加了不与mGlu₅相关的PSD95阳性突触后密度（PSD）斑点的比例，表明NEGR1影响mGlu₅在突触的定位。

在信号转导方面，NEGR1敲低虽不改变Homer总表达水平，但显著降低了与mGlu₅共免疫沉淀的Homer量，表明NEGR1对mGlu₅-Homer相互作用具有重要调节作用。功能上，NEGR1敲低阻断了mGlu₅激动剂DHPG诱导的ERK1/2磷酸化增加，并降低了Arc/Arg3.1和BDNF的mRNA表达水平。值得注意的是，NEGR1敲低与mGlu₅特异性阻断剂CTEP处理无叠加效应，提示二者可能作用于相同的信号通路。然而，NEGR1敲低不影响DHPG刺激引起的细胞内Ca²⁺浓度升高，表明NEGR1不参与mGlu₅-Gα_q/11经典信号通路。

在药理学层面，研究人员评估了NEGR1敲低对mGlu₅ PAM VU0409551神经保护效应的影响。在shSCR对照神经元中，VU0409551处理可有效预防谷氨酸诱导的神经元凋亡（以染色质凝集为指标）和neurite变性（以β-III微管蛋白染色为指标）。然而，在NEGR1敲低神经元中，VU0409551的神经保护效应完全丧失。进一步使用活/死细胞活力检测证实了这一结果，并发现MEK抑制剂PD98059可消除shSCR神经元中VU0409551的神经保护作用，但对shNEGR1神经元无额外影响，表明VU0409551的神经保护机制依赖于NEGR1和MEK/ERK通路的共同参与。

三、主要技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：基于mGlu₅^+/+（n=6）和mGlu₅^?/?（n=2）小鼠海马裂解物的免疫沉淀结合纳米级液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）蛋白质组学分析，样本由法国斯特拉斯堡IBMC蛋白质组学平台分析；免疫共沉淀实验验证蛋白相互作用，样本来自C57/BL6小鼠皮层和海马组织以及E15小鼠胚胎原代皮层-纹状体神经元培养物；慢病毒介导的shRNA敲低NEGR1表达；细胞表面生物素化实验检测质膜蛋白定位；免疫荧光结合共聚焦显微镜分析突触定位；Western blot检测蛋白表达和磷酸化水平；RT-qPCR检测基因表达；Fura-2 AM荧光法测量细胞内Ca²⁺浓度；以及凋亡检测和活/死细胞活力分析评估神经保护效应。

四、研究结果分述

3.1 mGlu₅受体与细胞黏附分子相互作用：通过nanoLC-MS/MS蛋白质组学分析，鉴定出21个在mGlu₅^+/+小鼠海马免疫沉淀物中显著富集的蛋白，包括已知的Homer1、G蛋白亚基和mGlu₁，以及新发现的细胞黏附分子NEGR1、Thy-1和Contactin-1。免疫共沉淀实验在脑组织和原代神经元培养物中均证实了mGlu₅与NEGR1的特异性相互作用。

3.2 NEGR1对mGlu₅细胞定位的重要性：NEGR1敲低不改变mGlu₅总蛋白水平和质膜定位，但通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析发现，NEGR1敲低增加了不与mGlu₅共定位的PSD95阳性斑点比例，表明NEGR1影响mGlu₅在突触的定位。

3.3 NEGR1调节mGlu₅-Homer相互作用并调节受体细胞信号：NEGR1敲低显著减少了与mGlu₅共免疫沉淀的Homer量，阻断了DHPG诱导的ERK1/2磷酸化，并降低了Arc/Arg3.1和BDNF表达。但NEGR1敲低不影响DHPG诱导的细胞内Ca²⁺升高。

3.4 NEGR1对VU0409551介导的mGlu₅依赖性神经保护至关重要：在shSCR神经元中，VU0409551可预防谷氨酸诱导的凋亡性细胞死亡和neurite变性；而在shNEGR1神经元中，VU0409551的神经保护效应丧失。MEK/ERK通路抑制剂PD98059可消除shSCR神经元中VU0409551的保护作用，但对shNEGR1神经元无影响。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次揭示了细胞外蛋白NEGR1作为mGlu₅受体结合伴侣的生物学功能。与大多数在受体胞内C端区域与mGlu₅相互作用的蛋白伴侣不同，NEGR1作为GPI锚定的细胞外蛋白，其与mGlu₅的相互作用只能通过受体胞外区域发生。研究人员推测，NEGR1可能通过稳定受体特定构象，跨膜传递构象变化，从而调节mGlu₅胞内C端区域与Homer等胞内蛋白伴侣的可及性。鉴于NEGR1存在于脂筏中，其可能作为细胞外支架蛋白调节mGlu₅在突触/突触周围的分布和信号转导。

研究结论指出，通过将NEGR1鉴定为mGlu₅的新结合伴侣，本研究为理解mGlu₅偏向性信号机制开辟了新途径。NEGR1敲低导致mGlu₅信号转导和药理学特性发生改变，证明该相互作用具有功能性影响。研究人员提出，与Homer 1类似，NEGR1可能作为细胞外支架蛋白，调节mGlu₅突触定位和信号转导。重要的是，NEGR1对于VU0409551发挥神经保护作用至关重要。目前针对神经退行性疾病的疾病修饰药物有限，针对mGlu₅受体的神经保护分子的药理学表征有望为神经退行性疾病患者开发新疗法做出贡献。