《Influenza and Other Respiratory Viruses》：Use of Metagenomic Next-Generation Sequencing to Investigate Respiratory Pathogens in Influenza-Negative Nasopharyngeal Swabs From Cameroon's National Influenza Surveillance
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背景：在喀麦隆，国家流感监测可识别流感阳性病例，但非流感急性呼吸道感染（ARIs）的病因仍缺乏充分表征。研究人员应用宏基因组二代测序（mNGS）调查通过国家流感监测采集的流感阴性鼻咽拭子中的呼吸道病原体。
方法：研究人员分析了2023年9月至12月期间从流感
背景：在喀麦隆，国家流感监测可识别流感阳性病例，但非流感急性呼吸道感染（ARIs）的病因仍缺乏充分表征。研究人员应用宏基因组二代测序（mNGS）调查通过国家流感监测采集的流感阴性鼻咽拭子中的呼吸道病原体。
方法：研究人员分析了2023年9月至12月期间从流感样疾病（ILI）或严重急性呼吸道感染（SARI）患者中采集的199份流感阴性鼻咽拭子。制备混合DNA/RNA文库并在Illumina NovaSeq平台测序。使用METAMIC（v2.0）和SPAdes（V3.15.5）生物信息学流程进行分类学鉴定。
结果：在120/199份样本（60.3%，95% CI: 53.5%, 67.1%）中检出病毒序列，代表15种病毒。最常见病毒为鼻病毒（rhinovirus，43/131）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV，33/131）、流感病毒（influenza virus）、副流感病毒（parainfluenza virus）和肠道病毒（enterovirus）。还检出两种非呼吸道病毒（Rotavirus和Papillomavirus）。测序平均每份样本产生2610万条读段（reads），每份样本平均深度870.3，平均基因组覆盖度（genomic coverage）82%。鉴定出11例病毒合并感染（co-infections）。还检出若干细菌和真菌属（bacterial and fungal genera）。
结论：该研究表明，mNGS为表征喀麦隆呼吸道病原体提供了强大且无偏倚（unbiased）的方法，揭示流感阴性ARI病例中存在显著病毒多样性。然而，成本和生物信息学能力仍是常规实施（routine implementation）的主要障碍。需要纵向研究（longitudinal studies）和临床相关性分析，以加强解释并指导将mNGS整合入国家监测。
论文主体解读：急性呼吸道感染（acute respiratory infections, ARIs）是全球感染性疾病相关发病和死亡的主要原因，临床范围可从普通感冒等自限性疾病到肺炎和急性呼吸窘迫综合征等严重疾病，病原包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。喀麦隆约24%的ARI患者需要住院；在低中等收入国家（low- and middle-income countries, LMICs），可靠分子诊断工具可及性有限，ARI病因认识仍存在明显缺口。当前诊断主要依赖PCR（polymerase chain reaction），该类方法依赖已知病毒序列，难以识别意外或新发病原。喀麦隆自2007年开展流感监测，Centre Pasteur du Cameroun（CPC）为国家流感中心，每年从哨点采集约1000份呼吸道疾病患者样本，10年研究显示年阳性率为24%—29%，COVID-19扰乱了流感季节性并降低检出率。多年监测后，非流感ARI病因信息仍有限，既往研究主要依赖靶向PCR，可能漏检新发、再发、罕见或高度特异病原。因此，研究人员应用mNGS对喀麦隆流感监测中流感阴性鼻咽拭子进行呼吸道病原全面调查。该研究首次在喀麦隆应用mNGS调查流感阴性ARI病例呼吸道病原，揭示显著病毒多样性，显示mNGS作为无偏倚诊断工具的潜力，同时指出成本和生物信息学能力限制其常规应用，并建议多重呼吸道panel和纵向研究。
方法概括（不超过250字）：研究人员开展横断面研究，样本来自2023年9—12月喀麦隆国家流感监测哨点（7/10行政区）的流感阴性鼻咽拭子，患者符合ILI或SARI定义；最终对199份样本进行mNGS（150份ILI、49份SARI）。湿实验室采用机械破坏、酶消化和化学裂解提取总核酸，构建DNA/RNA文库，在Illumina NovaSeq 6000测序。干实验室使用MetaMIC v2.0和SPAdes v3.15.5流程，剔除人源及非病原序列，以>10 million reads和1E-5病原读段比例阈值判定，并设环境样本和ZymoBIOMICS标准品质控。病毒阳性样本进一步组装、共识序列构建、分型及系统发育分析。
3.1 研究人群的一般特征：通过横断面mNGS分析，199份鼻咽拭子成功检测，包括150份ILI和49份SARI，采集于2023年9—12月，来自喀麦隆10个行政区中的7个；研究人群含104名女性和95名男性，年龄0—80岁，平均14.1岁；4份样本未达到10 M阈值，被判为不可解释并排除。
3.2 病毒检测与遗传多样性：通过宏基因组测序、基因组组装和系统发育分析，全部鼻咽拭子平均产生2610万条reads，平均41%来自人基因组、43%来自细菌、3%来自真菌、1%来自病毒，其余12%来自未显著匹配已知数据库的其他病毒和非病原类群。病毒reads平均测序深度为870.3，120/199份样本（60.3%，95% CI: 53.5%, 67.1%）检出病毒；组装后病毒基因组平均覆盖度为82%（5%—100%）。共鉴定11例病毒合并感染，获得131条病毒序列，包括Rhinovirus（43/131）、RSV（33/131）、Influenza virus（14/131）、Parainfluenza virus（13/131）、Enterovirus（11/131）、Adenovirus（4/131）、Cytomegalovirus（3/131）、Metapneumovirus（2/131）、Polyomavirus（2/131）、SARS-CoV-2（1/131）、Torque teno virus（1/131）、Human Coronavirus HKU1（1/131）和Epstein–Barr virus（1/131）；另在2例患者中检出Rotavirus和Papillomavirus两种非呼吸道病毒。92.4%（121/131）的病毒株属于Rhinovirus、RSV、Influenza virus、Parainfluenza virus和Enterovirus五类主要呼吸道病毒。系统发育分析显示Rhinovirus遗传变异显著，鉴定23个不同亚型，分属Enterovirus alpharhino（RV-A）、Enterovirus betarhino（RV-B）和Enterovirus cerhino（RV-C）；Enterovirus strains分为Enterovirus alphacoxsackie（EV-A）、Enterovirus betacoxsackie（EV-B）和Enterovirus coxsackiepol（EV-C）三血清型；Influenza strains包括5株Influenza A virus、4株Influenza B virus和5株Influenza C virus；RSV序列聚为RSV-A和RSV-B两型，以A型为主；Parainfluenza virus对应Human orthorubulavirus 4和Human respirovirus 1；其余病毒多样性较低，序列聚为单一型。
3.3 细菌和真菌检测：通过mNGS分类分析，平均43%和3%的reads分别来自细菌和真菌；细菌和真菌分别在61份和21份/199份鼻咽拭子中检出。检出的细菌包括Chlamydia pneumoniae、Corynebacterium（propinquum、efficiens、urealyticum、yudongzhengii、pseudodiphtheriticum、doosanense等）、Enterobacter hormaechei、Haemophilus（influenzae、aegyptius、haemolyticus、seminalis、caudoviricetes sp.、haemolyticus）、Klebsiella pneumoniae、Moraxella（catarrhalis、nonliquefaciens、osloensis）、Staphylococcus（aureus、epidermidis）、Streptococcus（oralis、pneumoniae、pyogenes、mitis）和Actinomyces（oris、naeslundii）；真菌包括Candida（parapsilosis、metapsilosis、orthopsilosis、auris）。
讨论部分总结：原文指出，ARIs症状非特异，病因诊断困难，资源有限地区依赖靶向PCR，仅能检测已知病原，促使无偏病毒组方法的应用。该研究首次在喀麦隆应用mNGS调查流感阴性ARI，病毒reads仅占总测序数据1%，但60.3%样本检出病毒；该检出率高于肯尼亚的30.5%（58/190）、低于南非的97.6%（82/84），原文将其与样本处理或测序深度差异相联系。mNGS具病原检测优势，但资源有限地区常规诊断仍受试剂成本高和生物信息学专长有限制约；降低试剂成本、扩大生物信息学培训是关键，建议采用已商业化且覆盖近乎全部病毒的多重呼吸道panel，或整合本研究中常检出病毒的多重panel。研究样本为流感监测阴性，但mNGS检出14份流感病毒；Influenza C未纳入喀麦隆流感监测常规呼吸道检测panel，故其检出并不意外；Influenza A和B在先前阴性样本中检出更值得关注。比较mNGS与常规PCR监测的研究报道两法存在差异，但未证明mNGS敏感性更优；整合mNGS与常规PCR可更准确表征资源有限地区呼吸道感染。研究意外检出Rotavirus和Papillomavirus，为喀麦隆呼吸道样本首次报告，但其与临床症状的关联尚不明确，需进一步确认是否为真正呼吸道病原或污染。细菌和真菌reads比例高，原文认为可由环境污染DNA或无症状定植解释；Polyomavirus、CMV、Actinomyces oris、Moraxella catarrhalis、Corynebacterium spp.、Haemophilus influenzae、Candida parapsilosis和C. pseudohaemulonis等通常属于正常口咽 microbiota，不应视为真正呼吸道病原。mNGS细菌结果解释复杂，主要挑战包括方法高灵敏度、假阳性风险及缺乏界定临床相关性的标准化阈值。EBV检出值得关注，既往报道鼻咽样本EBV DNA与鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）相关；喀麦隆位于非流行区，但情况未知，需进一步研究。局限包括地区代表性受限（北、极北和Adamawa三个北部地区样本未分析）、仅纳入有症状患者、采样仅覆盖2023年9—12月、缺乏临床相关性，以及有证据提示ILI定义对RSV诊断不准确、敏感性仅11%。未来需更广地理采样、纳入无症状个体、开展季节性比较并整合临床数据。
研究结论部分翻译：本研究强调mNGS作为临床病毒学中强大诊断工具的价值。然而，其在资源有限环境中的常规应用仍受试剂成本、基础设施需求和有限生物信息学能力制约。为加强国家呼吸道疾病监测，研究人员建议采用多重呼吸道panel（multiplex respiratory panels），其已覆盖本研究所鉴定几乎所有病毒且已商业化。此外，需要纵向研究以捕捉呼吸道病原传播的季节性变化及mNGS发现的临床解释。
