纵向蛋白质组学整合多组学揭示直肠癌新辅助化疗应答的免疫-基质互作分子驱动因素及RAC2枢纽作用

《Pharmacological Research》：Longitudinal Proteomics Integrated with Multi?Omics Reveal Molecular Drivers of Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Rectal Cancer

大队列纵向蛋白质组学揭示直肠癌新辅助化疗（NAC，neoadjuvant chemotherapy）应答机制。基线免疫激活可预测直肠癌NAC应答。NAC诱导纤维化重塑，应答者独特呈现CD8⁺ T细胞相关癌症相关成纤维细胞（CAF，cancer-associated fibroblasts）激活。RAC2（Rho GTPase家族成员）驱动免疫-基质串扰（immune–stromal crosstalk）并决定治疗敏感性。RAC2敲低可抑制基线肿瘤生长，但在奥沙利铂（oxaliplatin）暴露下增强肿瘤进展。

研究背景与目的：结直肠癌（CRC，colorectal cancer）为全球常见恶性肿瘤，直肠癌约占其中三分之一。局部晚期直肠癌（LARC，locally advanced rectal cancer）的标准治疗为新辅助放化疗（nCRT）或新辅助化疗（NAC，neoadjuvant chemotherapy）后行根治性肠系膜切除，但疗效差异大，仅约10%—15%患者达到病理完全缓解（pCR，pathological complete response）。NAC较nCRT毒性更低并可改善无病生存期（DFS，disease-free survival），但NAC应答的分子决定因素、治疗中的动态微环境重编程及其与长期预后的联系仍不清楚。基因组和转录组分析因mRNA丰度常不能反映功能蛋白而难以识别可临床转化的标志物；蛋白质组学可直接刻画翻译后修饰、蛋白互作和代谢活性等功能状态。四维数据非依赖采集（4D-DIA，four-dimensional data-independent acquisition）整合离子淌度分离与DIA，提高分析深度、灵敏度和数据完整性，适用于大规模福尔马林固定石蜡包埋（FFPE，formalin-fixed paraffin-embedded）队列。但LARC中治疗前微环境状态如何决定NAC应答、NAC诱导的细胞状态重塑如何影响长期结局，仍缺乏纵向全蛋白组刻画。该研究发表于《Pharmacological Research》。研究人员对156例接受NAC的LARC患者治疗前后配对标本进行4D-DIA蛋白质组学分析，构建与治疗应答、DFS和总生存期（OS，overall survival）关联的纵向图谱，提出治疗前免疫活跃微环境赋予治疗敏感性，NAC诱导免疫相关CAF重塑并与长期生存相关，基线RAC2升高成为连接免疫激活、基质重编程和治疗应答的中心节点，提示RAC2为潜在治疗靶点。

关键技术方法：研究人员回顾性纳入2012—2021年哈尔滨医科大学肿瘤医院接受XELOX或FOLFOX方案NAC、未放疗并完成根治性肠系膜切除的LARC患者156例，获得271份治疗前后FFPE组织；外部验证采用GSE139255、GSE35640及Gao等单细胞数据集。采用4D-DIA蛋白质组学（timsTOF Pro/Evosep One，Spectronaut，FDR<1%）并行QC-SVR批次校正，最终保留2128个蛋白。生物信息分析包括偏最小二乘判别分析（PLS-DA，Partial Least Squares Discriminant Analysis）、limma差异分析、基因集富集分析（GSEA，Gene Set Enrichment Analysis）/基因本体（GO，Gene Ontology）/基因集变异分析（GSVA，Gene Set Variation Analysis）、免疫/基质评分算法（ESTIMATE）、微环境细胞群计数（MCP-counter）、免疫与肿瘤纯度估计（EPIC）、Genomics of Drug Sensitivity in Cancer（GDSC）数据库及Seurat/Monocle3/CellChat单细胞分析；体内外采用蛋白印迹（Western blot）、CCK-8、Transwell、TUNEL及MC38-C57BL/6和LOVO-BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型并用奥沙利铂干预。

研究结果：
3.1 蛋白质组学概览：通过对最终175份标本（44份治疗前、131份治疗后）进行质控后蛋白质组分析，PLS-DA提示应答组与治疗状态间蛋白模式存在差异；生存分析显示应答者复发风险更低、DFS更长，而OS无显著差异。
3.2 治疗前免疫浸润和RAC2与治疗应答相关：通过44例治疗前样本差异蛋白、GSEA/GSVA/ESTIMATE、蛋白-蛋白相互作用（PPI，protein–protein interaction）网络、GDSC药敏、ROC曲线及列线图/DCA/CIC，并在GSE139255和GSE35640中验证，发现应答者治疗前免疫炎症通路和免疫浸润更高；RAC2为最强应答相关分子，与较长DFS、免疫评分正相关，与5-氟尿嘧啶（5-FU）和奥沙利铂IC₅₀负相关，预测模型训练集和测试集AUC分别为0.867和0.857；但高RAC2与较差OS相关，提示其作用具有背景依赖性。
3.3 NAC期间免疫相关纤维化重塑预测良好结局：通过配对前后差异蛋白、GO富集、EPIC/MCP-counter及生存关联分析，发现NAC后两组共同上调100个蛋白并富集纤维化过程；应答者MCP评估的成纤维细胞升高更明显，EPIC呈趋势但未达显著；应答者CD8⁺ T细胞（细胞毒性T细胞）轻度增加而非应答者显著下降；治疗后应答者纤维化通路和成纤维细胞丰度更高，且成纤维细胞与OS和DFS改善相关，提示NAC在应答者中促进支持性、免疫链接的纤维化重塑。
3.4 应答者与RAC2-high组在NAC期间通路动态一致：通过配对GSEA比较应答/非应答与RAC2-high/low组治疗前后通路，发现应答者与RAC2-high组高度一致，涉及ECM–受体相互作用、PI3K–Akt信号、整合素信号、药物代谢–细胞色素P450、蛋白聚糖及DNA复制等；非应答者与RAC2-low组一致；应答者NAC后RAC2显著下降，提示基线RAC2-high肿瘤沿治疗应答轨迹。
3.5 基线肿瘤RAC2接收成纤维细胞输入并激活CD8⁺ T细胞促进应答：通过Gao等单细胞数据的UMAP、差异表达、GSEA、伪时间及CellChat分析，发现基线RAC2主要富集于T/B细胞，但应答者多种细胞包括肿瘤细胞RAC2更高；肿瘤细胞高RAC2与白细胞跨内皮迁移、细胞黏附分子（CAMs）等应答相关通路相关；NAC后应答者肿瘤RAC2下降；RAC2-high肿瘤细胞经HLA-A（human leukocyte antigen-A，人类白细胞抗原-A）–CD8A（CD8 alpha chain，CD8α链）向CD8⁺ T细胞输出信号，并接受成纤维细胞COL1A1（collagen type I alpha 1 chain，I型胶原α1链）–SDC4（syndecan-4，多配体蛋白聚糖-4）输入，且NAC中这些信号随RAC2下降，提示RAC2-high肿瘤细胞构成免疫–基质通讯枢纽。
3.6 肿瘤细胞RAC2的体内外验证：通过LOVO和MC38细胞shRNA敲低、CCK-8、Transwell、TUNEL、Western blot及裸鼠和C57BL/6皮下移植瘤奥沙利铂干预与双因素方差分析，发现RAC2敲低增加奥沙利铂IC₅₀，降低基础增殖、迁移和侵袭，但在药物应激下增强迁移侵袭并减少凋亡；体内无治疗时RAC2敲低抑制肿瘤生长，而在奥沙利铂下肿瘤更大更重；RAC2敲低减弱奥沙利铂诱导的BAX、BIM和cleaved caspase-3上调及Bcl-2抑制；治疗后高RAC2与更好OS和DFS相关，表明RAC2为受化疗暴露重塑的背景依赖调节因子。

讨论与结论：讨论部分指出，应答者治疗前免疫相关通路活性和免疫浸润更高，与多癌种中基线免疫激活预测新辅助治疗应答的观察一致；NAC应答与DFS延长而非OS相关，提示治疗敏感性主要影响早期复发而非长期死亡。基线RAC2高与化疗敏感性相关，而其与OS负相关提示存在治疗非依赖的生物学效应。RAC2属Rho GTPase家族，调节细胞骨架、活性氧（ROS，reactive oxygen species）产生和免疫细胞功能；无NAC时其促瘤作用可能占优，奥沙利铂诱导ROS和DNA损伤，RAC2可增强ROS及caspase-3相关凋亡，RAC2敲低则削弱BAX、BIM和cleaved caspase-3上调。单细胞分析显示总RAC2主要见于免疫细胞，但肿瘤细胞内在RAC2变异与治疗敏感性及免疫–基质通讯密切相关。应答者NAC后CAF增加并伴CD8⁺ T细胞浸润，非应答者CD8⁺ T细胞下降，提示免疫相关CAF亚群优先扩增；治疗后CAF水平与DFS和OS延长相关。NAC诱导的应答相关蛋白上调可能反映与良好结局相关的适应性重塑。研究优势为首次在LARC中应用纵向4D-DIA蛋白质组学、识别RAC2为连接基线免疫激活与基质重塑的关键介导因子，并经蛋白质组、转录组、单细胞和实验数据多层级验证；局限包括治疗前活检材料有限导致可检测蛋白较少、仍需大型前瞻性队列验证、皮下模型不能完全复现原发直肠肿瘤的上皮–基质–免疫互作，以及尚需更多功能研究阐明RAC2机制。研究结论翻译：总之，LARC的NAC应答似乎是一个动态生物学过程，由基线免疫启动（immune priming）、RAC2介导的免疫–基质串扰（immune–stromal crosstalk）及NAC诱导的CAF重塑共同塑造，并可能共同影响长期临床结局。