剪接因子FAM50A通过剪接依赖性致癌环状RNA circSDK1及DUSP22介导的MAPK/FAK通路激活促进食管鳞状细胞癌进展

《Cell Discovery》：FAM50A promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via splicing-dependent oncogenic circSDK1- and DUSP22-mediated MAPK/FAK activation

　　

FAM50A（family with sequence similarity 50 member A，序列相似性家族50成员A）是一种关键的致癌剪接因子，参与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）的发生发展。多组学和多队列分析显示，FAM50A在ESCC中表达上调，且与不良预后相关。功能研究表明，FAM50A主要通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）和黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）促进ESCC细胞的增殖和迁移。研究人员进一步表征了FAM50A结合的RNA基序，并建立了其全转录组剪接图谱。值得注意的是，研究人员发现了一个新的FAM50A依赖性反向剪接事件，产生circSDK1，其来源于sidekick细胞黏附分子1（sidekick cell adhesion molecule 1, SDK1）前体mRNA的外显子2-4。机制上，circSDK1结合双特异性磷酸酶22（dual-specificity phosphatase 22, DUSP22）并占据其磷酸酶结构域，抑制DUSP22介导的MAPKs和FAK去磷酸化，从而维持其持续激活。此外，转录因子TFAP2C可上调FAM50A表达。最后，研究人员将利福布汀鉴定为FAM50A的小分子抑制剂，并在细胞源性异种移植瘤、患者源性类器官和患者源性异种移植瘤模型中证实了其抗肿瘤疗效。总之，FAM50A通过FAM50A/circSDK1/DUSP22轴促进ESCC进展，导致MAPKs和FAK激活。对FAM50A进行遗传学或药理学（利福布汀）靶向干预是ESCC的一种有前景的治疗策略。

食管癌是全球第11位最常见恶性肿瘤、第7位致死性恶性肿瘤，5年生存率不足30%，其中食管鳞状细胞癌（ESCC）占85%以上。多数患者确诊时已处于晚期，即使接受手术、放化疗及免疫治疗等综合手段，仍有较高复发风险。异常剪接调控是肿瘤发生发展的重要驱动因素，剪接因子可通过调节经典线性剪接和反向剪接影响肿瘤恶性行为。FAM50A作为剪接体的核心组分，已被报道参与肿瘤转移过程，但其在肿瘤进展中调控剪接的分子机制、全转录组剪接景观和RNA结合位点仍不清楚，靶向FAM50A的小分子抑制剂也尚未见报道。

研究人员利用多队列和多组学数据系统筛选ESCC中预后相关的剪接因子，并结合蛋白组学分析和RNA干扰功能筛选，确定FAM50A为关键的致癌剪接因子。通过体外和体内功能实验证实，FAM50A促进ESCC细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT）及失巢凋亡抵抗。机制研究揭示，FAM50A直接结合SDK1前体mRNA并促进其反向剪接生成circSDK1，circSDK1通过占据DUSP22的磷酸酶结构域抑制其对MAPKs和FAK的去磷酸化，从而维持这两条信号通路的持续激活。此外，转录因子TFAP2C直接结合FAM50A启动子区并激活其转录。基于虚拟筛选和分子动力学模拟，研究人员鉴定利福布汀为FAM50A的小分子抑制剂，并在细胞源性异种移植（CDX）、患者源性类器官（PDO）和患者源性异种移植（PDX）模型中验证了其单药及与顺铂联用的抗肿瘤疗效。该研究为ESCC的靶向治疗提供了新策略，论文发表在《Cell Discovery》。

在技术方法上，研究人员整合了多队列转录组数据（GSE53624、TCGA-ESCC等）和队列蛋白质组数据（Changhai队列I，24例转移性ESCC患者的配对癌组织、癌旁组织及转移淋巴结），结合RNA干扰筛选、RNA测序（RNA-seq）、RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）和环状RNA测序（circRNA-seq）绘制FAM50A的剪接调控图谱；利用CDX、PDO和PDX模型进行体内药效验证；通过AutoDock Vina虚拟筛选FDA批准药物库并结合分子动力学模拟评估候选抑制剂与FAM50A的结合稳定性；采用免疫共沉淀、RNA pull-down、电泳迁移率变动分析（EMSA）和体外磷酸酶活性试验验证蛋白质-RNA及蛋白质-蛋白质之间的直接相互作用。

研究结果主要包括以下内容。

**ESCC患者中FAM50A表达升高与进展和不良预后相关**：274个剪接因子的预后分析结合多队列验证显示，FAM50A在ESCC组织和转移淋巴结中均显著上调，免疫组化证实其蛋白水平升高，多个独立队列的Kaplan-Meier分析表明高表达FAM50A与患者总生存期缩短显著相关。

**FAM50A通过MAPKs和FAK激活促进ESCC恶性表型**：基因集富集分析显示FAM50A靶基因富集于MAPK信号通路、黏着斑和细胞-细胞连接。Western blot证实FAM50A敲低降低MAPK三个亚族（ERK、JNK、p38）及FAK在Y⁵⁷⁶/Y⁵⁷⁷和Y³⁹⁷位点的磷酸化水平，FAM50A过表达则相反；FAM50A还促进EMT、增强细胞外基质黏附并抑制失巢凋亡，且不影响AKT和NF-κB磷酸化，提示其通路特异性。

**FAM50A结合位点和剪接事件的全转录组图谱**：RIP-seq显示79.31%的FAM50A结合RNA为mRNA，结合区富集于外显子和内含子，HOMER算法鉴定出最丰富的RNA基序为GGGGCCUC 8-mer。rMATS分析鉴定出1477个FAM50A依赖性经典可变剪接事件，其中外显子跳跃占65.88%；结合circRNA-seq，共鉴定出137个上调和154个下调的FAM50A调控circRNA。

**FAM50A通过直接结合前体mRNA促进circSDK1反向剪接**：FAM50A依赖性circRNA与ESCC组织中上调circRNA取交集获得hsa_circ_0134225（circSDK1），其来源于SDK1基因外显子2-4，长度为415 nt，主要定位于细胞质，且对RNase R和放线菌素D处理高度稳定。RIP-qPCR和RNA pull-down证实FAM50A蛋白结构域3直接结合SDK1前体mRNA内含子1，从而促进反向剪接。

**FAM50A的致癌功能部分依赖于circSDK1**：circSDK1敲低抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭，并增加失巢凋亡；circSDK1过表达可显著挽救FAM50A敲低引起的增殖抑制、迁移减弱和肿瘤生长减缓。在CDX模型中，circSDK1逆转FAM50A敲低对肿瘤的抑制作用，且线性SDK1 mRNA无此功能，证明circSDK1是FAM50A激活MAPK和FAK通路的功能性效应分子。

**circSDK1通过占据DUSP22磷酸酶结构域增加MAPKs和FAK磷酸化**：circSDK1无蛋白编码潜力，不结合AGO2，不发挥miRNA海绵作用。AlphaFold 3分子对接预测circSDK1结合DUSP22的磷酸酶结构域，RIP-qPCR、EMSA和免疫荧光共定位实验证实两者直接结合。体外磷酸酶活性实验表明circSDK1以剂量依赖方式抑制DUSP22催化活性，DUSP22过表达可逆转circSDK1诱导的MAPKs和FAK磷酸化升高、失巢凋亡抵抗及EMT。

**转录因子TFAP2C促进FAM50A转录**：通过TFtarget、JASPAR和ChIPAtlas数据库预测并经双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀-qPCR验证，TFAP2C直接结合FAM50A启动子区（-163至-173 bp）并激活其转录。TFAP2C敲低抑制ESCC细胞恶性表型，FAM50A过表达可挽救该表型；多队列分析显示TFAP2C在ESCC中表达上调，且与FAM50A表达呈正相关。

**利福布汀抑制FAM50A并增强顺铂疗效**：基于AutoDock Vina虚拟筛选，从3158个FDA批准和药典药物中鉴定利福布汀为FAM50A高亲和力抑制剂，其与FAM50A的Glu197、Glu200、Lys219和Asn281残基相互作用，分子动力学模拟证实复合物稳定。利福布汀抑制FAM50A依赖性经典剪接和反向剪接事件，降低MAPKs和FAK磷酸化水平。在CDX、PDO和PDX模型中，利福布汀单药显著抑制肿瘤生长，与顺铂联用产生协同效应，进一步降低Ki67指数、抑制EMT并促进凋亡。

在讨论部分，研究人员指出FAM50A可增强ESCC转移的完整过程：通过促进EMT破坏细胞-细胞连接以起始转移，通过增强失巢凋亡抵抗提高播散期细胞存活，通过促进细胞外基质黏附增加转移定植能力。circSDK1的发现补充了剪接因子依赖性circRNA在肿瘤中的功能机制。利福布汀作为FDA-approved药物，其靶向FAM50A的用途具有临床转化潜力。该研究也存在局限性：FAM50A可诱导广泛的剪接事件，本研究仅验证了一个致癌下游靶点；MAPKs/FAK与EMT及失巢凋亡之间的精细调控关系仍需进一步阐明。

研究结论部分可翻译为：总之，本研究证明FAM50A在ESCC中是一个新型致癌剪接因子和预后标志物。研究人员进一步揭示了FAM50A的结合基序及其全转录组结合模式，鉴定了FAM50A依赖性经典可变剪接和反向剪接事件。此外，研究发现FAM50A通过FAM50A/circSDK1/DUSP22轴发挥致癌作用，TFAP2C可激活FAM50A转录导致其异常上调。最后，利福布汀靶向抑制FAM50A可能是ESCC的一种可行治疗策略。