光生物调节与Wnt/β-Catenin通路在根尖形成中的作用：理论依据与证据缺口

《Photodiagnosis and Photodynamic Therapy》：Photobiomodulation and the Wnt/β-Catenin Pathway in Apexogenesis: Rationale and Evidence Gaps

　　

专业摘要翻译： 根尖形成（apexogenesis）是一种生理过程，也是活髓治疗的一种形式，旨在保留牙根发育不完全的未成熟牙齿中根髓的生物学特性，从而允许生理性牙根继续生长、根尖闭合以及牙本质壁增厚。Wnt（Wingless-related integration site）信号通路，特别是经典Wnt/β-Catenin通路，通过β-Catenin–Axin2–Runx2轴驱动成牙本质细胞分化和根部牙本质形成。光生物调节治疗（photobiomodulation therapy, PBMT），即低水平激光治疗，已被提议作为再生牙髓治疗的辅助方法，因其对细胞代谢具有非侵入性和非热性的生物刺激作用。体外（in vitro）研究表明，PBMT最一致地增强牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs）和根尖乳头干细胞（stem cells from the apical papilla, SCAPs）的成牙/成骨分化。然而，关于增殖的报道结果不一致，且主要依赖MTT（一种代谢活性测定法）。红光（640–660 nm）和近红外光在低至中等能量密度下增强了DPSC/SCAP分化，但尚未确定最佳波长、能量密度或照射次数。值得注意的是，尚无研究直接评估PBMT在DPSCs、SCAPs中诱导的Wnt/β-Catenin通路激活，这代表了一个关键的研究空白。因此，PBMT在根尖形成中的治疗获益仍未得到证实。优先研究应包括在标准化照射条件下直接测量β-Catenin、Axin2和GSK3β活性，通过牙本质的光传递研究以及动物实验。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

根尖形成（apexogenesis）是活髓治疗的一种形式，其核心目标在于保留牙根发育未完全的未成熟恒牙中根髓的生物学活性，从而促进牙根继续生理性生长、根尖闭合以及牙本质壁增厚。这一过程与根尖诱导（apexification）有本质区别——后者是在无活力未成熟牙齿的根尖诱导形成钙化屏障，牙根发育并不完整，牙本质壁仍然薄弱。在调控细胞增殖与分化的众多信号通路中，Wnt（Wingless-related integration site）通路占据特殊地位，它在牙齿发育的多个阶段——包括牙根形成和牙本质-牙髓复合体重塑——发挥重要调控作用。经典Wnt/β-Catenin通路中，β-Catenin蛋白在调控干细胞——特别是根尖乳头干细胞（SCAPs）和牙髓干细胞（DPSCs）——的增殖与分化中扮演核心角色。近年研究证实，β-Catenin缺失可导致牙根牙本质形成严重障碍，表明Wnt/β-Catenin信号对根部牙本质发生至关重要。

光生物调节治疗（PBMT），即低水平激光治疗，因其对细胞代谢具有非侵入性、非热性的生物刺激作用，已被作为再生牙髓治疗的辅助手段。PBMT可通过细胞色素c氧化酶介导的电子传递和ATP产生增强线粒体活性，调节活性氧（ROS），并影响细胞增殖与分化。尽管体外和体内研究提示PBMT具有促进成牙本质细胞分化、上调牙本质形成基因表达和牙髓组织再生的潜力，但其在根尖形成中发挥作用的主要细胞内机制仍不清楚，这可能是各研究结果不一致的原因。本综述的核心问题并非PBMT是否影响根尖形成过程，而是它如何影响牙源性干细胞，重点关注Wnt/β-Catenin信号通路这一细胞增殖和分化的主要调控通路。

二、研究内容与主要结论

研究人员围绕三个核心问题展开综述：（1）根尖形成需要支持哪些细胞过程，Wnt/β-Catenin信号在其中发挥什么作用？（2）PBMT通过何种机制作用于这些过程，该机制与Wnt/β-Catenin信号有何关联？（3）DPSCs和SCAPs研究中有哪些证据表明PBMT影响这些过程，证据的一致性如何，目前能得出什么结论？

在Wnt/β-Catenin通路与牙根发育的关系方面，研究指出经典Wnt/β-Catenin信号参与牙齿发育的早期和晚期阶段。在牙根成牙本质细胞和成牙骨质细胞中，β-Catenin缺失（OC-Cre; Ctnnb1^fl/fl小鼠模型）会导致磨牙牙根形成严重紊乱，因为前成牙本质细胞中β-Catenin缺失降低了细胞分化和增殖，通过阻止根部牙本质合成而导致牙根丧失。然而，冠部成牙本质细胞中β-Catenin缺失并不产生这些结果。此外，非经典Wnt信号也参与牙根发育，Ror2蛋白在牙间充质中的表达及其缺失会导致间充质细胞分化和增殖紊乱以及磨牙牙根大小改变。Wnt抑制剂NOTUM——一种内源性分泌型羧酸酯酶，通过去除Frizzled结合所需的棕榈油酸部分而胞外灭活Wnt配体，其本身也是Wnt靶基因，形成负反馈回路——对于正常磨牙牙根发育是必需的。Runx2（成骨和成牙本质分化的转录因子）的消融导致NOTUM表达降低、Wnt信号表达增加以及成牙本质分化和牙根形态改变。因此，正常牙根发育不仅需要Wnt活性的上调，更需要其精确调控。

在Wnt驱动的牙本质修复分子介质方面，能够表达Axin2（作为自分泌Wnt信号）的细胞在牙齿损伤后增殖并分化为成牙本质样细胞，负责修复性牙本质的形成。Runx2是成牙本质分化的重要转录因子，其表达依赖于β-Catenin。Han等人的研究表明，β-Catenin敲低破坏了成牙本质分化，β-Catenin与Runx2启动子的结合以及Runx2表达均降低；而氯化锂（LiCl）积累β-Catenin则产生相反效应。在修复性牙本质形成过程中，β-Catenin在成牙本质样细胞和穿孔区下方的部分牙髓细胞中显著存在，而正常成牙本质细胞中β-Catenin存在水平较低，正常健康牙髓中Runx2表达缺失。染色质免疫沉淀显示成牙本质分化增强了β-Catenin与Runx2启动子的结合。鉴于Runx2在牙根发育和冠部成牙本质发生中的重要性，β-Catenin–Runx2轴可能代表根尖形成中的关键分子连接。

三、关键技术方法

本论文为综述性研究，未开展原始实验。研究人员系统检索并汇总了10项体外研究，这些研究使用的主要技术方法包括：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）比色法评估细胞代谢活性；碱性磷酸酶（ALP）活性测定；茜素红染色（ARS）检测矿化结节形成；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测成牙/成骨分化相关基因（如DSPP、DMP-1、BSP、OCN、Runx2、Osterix等）的mRNA表达；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-β2（TGF-β2）等分泌因子；台盼蓝染色直接细胞计数、annexin V/碘化丙啶（PI）染色和细胞周期流式细胞术（仅Zaccara等研究采用）；扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）和X射线衍射（XRD）分析矿化组织形成。细胞来源为人类DPSCs和SCAPs，部分研究使用三维生物陶瓷支架或钛片等基质环境。

四、研究结果

4.1 对代谢活性的影响

多项研究报告红光波段二极管激光（640–660 nm）在低能量密度下可增加DPSCs和SCAPs的MTT衍生代谢活性，作者将其解释为增殖。Zaccara等使用660 nm InGaAlP激光（30 mW，连续模式）以0.5和1.0 J/cm2两个剂量在0和48小时两次照射人DPSCs，台盼蓝计数在72小时时两种剂量均高于对照组，96小时时仅1.0 J/cm2剂量仍显著升高；活力、凋亡和细胞周期分布均不受影响。Rezaei等以660 nm二极管激光（100 mW，3 J/cm2，15秒）单次或间隔48小时两次照射DPSCs，结果显示两次照射组在第1、7、14天的MTT衍生代谢活性显著高于未照射对照组，提示重复剂量增强效应。Gutiérrez等以4、6、8 J/cm2剂量和650、808 nm两种波长照射SCAPs，发现650 nm、6 J/cm2单次剂量产生最高的MTT衍生反应，红外波长效果较差。

然而，多项研究表明PBMT与MTT衍生“增殖”的关系可能随细胞向分化方向进展而逆转或呈双相。Yang等发现蓝光LED（420–480 nm）以2、3、4 J/cm2剂量照射成骨培养基中培养的SCAPs，MTT衍生代谢活性降低，但成骨标志物表达同时增加，提示增殖与分化之间的平衡。Tabatabaei等以810 nm二极管激光（60 mW）每日照射DPSCs 7天，0.1和0.2 J/cm2剂量在常规培养基中增加MTT衍生活性，但相同剂量在成骨环境中显著降低MTT衍生活性并伴随分化标志物增加。Amid等以808 nm激光以3和5 J/cm2剂量照射钛片上的DPSCs，发现较低剂量（3 J/cm2）在96小时诱导更高的MTT衍生活性，增加剂量无额外获益，符合Arendt-Schultz原理。但并非所有研究均支持增殖效应——Pereira等使用660 nm InGaAlP激光以0.05至42 J/cm2的宽剂量范围（包括通过牙本质片模拟临床条件）照射健康或炎症牙髓来源的DPSCs，未观察到MTT衍生活性或成牙-成骨分化的显著变化。

4.2 对成牙本质和成骨分化标志物的影响

跨研究最一致的发现是PBMT后成牙本质和成骨分化标志物表达增加，包括碱性磷酸酶（ALP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、牙本质基质蛋白-1（DMP-1）、骨涎蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）以及Runx2和Osterix。Rahmati等比较了940 nm二极管激光（50 mW）与640 nm红光LED（1 W），两者均以4 J/cm2能量密度在24和48小时两次照射成骨培养基中的SCAPs，两种光源均刺激ALP、DSPP、DMP-1和BSP的mRNA表达并增加茜素红染色，但激光组的基因表达增加显著大于LED组。Theocharidou等以GaAlAs激光（660 nm，4 J/cm2）照射接种于镁基锌掺杂生物陶瓷支架上的DPSCs，结果显示DSPP（高达28.4倍）、BMP-2（高达22.4倍）、Osterix（高达18.5倍）和Runx2（第7天高达3.4倍）表达显著增加，ALP活性在第3和7天增加，第28天形成生物磷灰石样矿化组织，但MTT衍生代谢活性未受影响。Sivakumar等以810 nm激光（800 mW，4 J/cm2）照射接种于N-乙酰半胱氨酸功能化羟基磷灰石支架上的DPSCs，发现双重照射（第1和3天）较单次照射钙沉积增加71%、ALP活性增加75%、骨桥蛋白mRNA表达增加47.6%。

4.3 血管生成和牙本质生成分泌因子

Rezaei等发现660 nm（3 J/cm2）单次和两次照射均导致DPSCs释放VEGF和牙本质涎蛋白（DSP），呈时间和剂量依赖性，双剂量方案在第14天效果最显著。Gutiérrez等证明650 nm、6 J/cm2单次剂量可增加SCAPs中VEGF（第14天达峰）和TGF-β2（第7天达峰）的释放，同时伴随成骨矿化增强。

4.4 照射参数和微环境的影响

PBMT的生物学反应受波长、能量密度、照射模式（单次或重复）以及三维支架或细胞微环境改变（如钛表面或炎症条件）等多种因素影响。红光（640–660 nm）和近红外光（808–940 nm）均报道了阳性效果，现有证据未确定任何特定波长或能量密度范围的优越性。两项研究报告重复照射较单次照射改善分化结果，而Gutiérrez等发现单次与双次给药无差异。由于照射参数异质性大，部分研究报告无效果或增殖降低伴随分化增强，PBMT参数与根尖形成结局之间的关系尚未确立。

五、方法学评价与讨论总结

在方法学评价方面，10项研究中有9项使用MTT测定法。Sivakumar等仅通过定性显微照片报告增殖，Zaccara等以台盼蓝细胞计数、annexin V/PI染色和细胞周期分析补充MTT。没有研究使用克隆形成测定法、DNA合成测定法（EdU/BrdU掺入）或群体倍增分析。MTT还原依赖于NAD(P)H依赖性氧化还原酶活性，受细胞数量影响，但也受代谢状态、线粒体含量和培养条件影响，因此不能等同于活力或增殖。这一局限性在PBMT研究中尤为相关，因为PBMT被提议直接作用于线粒体呼吸——MTT信号的增加可能在没有相应细胞数量变化的情况下发生。反之，成骨培养基中报告的较低MTT值可能反映分化相关的代谢变化而非细胞分裂减少。唯一直接细胞计数来自Zaccara等的研究，照射培养物在72小时（两种能量密度）和96小时（仅1.0 J/cm2）计数高于对照组，与MTT数据方向一致。

在讨论部分，研究人员指出尚无研究直接评估PBMT对DPSCs或SCAPs中Wnt/β-Catenin通路活性的影响。该通路与PBMT之间的假设联系基于间接研究，尚未得到证实。PBMT反应性标志物与Wnt靶点重叠，但这些标志物并非Wnt特异性，BMP/Smad等其他通路也可诱导它们。因此，PBMT后这些标志物的增加不能仅归因于Wnt/β-Catenin激活。最接近的证据是Wang等对人脱落乳牙干细胞（SHED）的研究，该研究表明980 nm照射增强骨/成牙分化，且该效应通过BMP/Smad与Wnt/β-Catenin通路之间的串扰发生。但该证据是间接的，因为细胞类型不同且未检查根尖形成。此外，正常牙根生长需要Wnt活性的精细调控而非简单增加。因此，即使PBMT激活该通路，其对根尖形成的获益也不会自动成立。

六、研究结论翻译

在有限且异质性的体外文献范围内，三个问题可回答如下：第一，Wnt/β-Catenin信号已被证明对根部牙本质发生和修复性牙本质形成至关重要；然而，牙根发育需要Wnt活性的调控而非单纯上调。第二，PBMT被提议通过线粒体光感受发挥作用，其与Wnt/β-Catenin信号的关联是推断性的：PBMT反应性标志物与Wnt靶点重叠，但并非Wnt信号特异性，且PBMT对该通路的影响尚未在DPSCs或SCAPs中研究。第三，PBMT最一致地与DPSCs和SCAPs中成牙本质和成骨标志物表达增加及矿化相关，而其“增殖”效应不一致，且由于增殖主要通过代谢测定法（MTT）评估——可能不能准确反映细胞分裂能力——不能等同于细胞数量增加；尚无波长、能量密度或给药方案被证明优越。因此，PBMT在根尖形成中的治疗获益仍未得到证实。优先研究包括在标准化照射条件下直接测量β-Catenin、Axin2和GSK3β活性，通过牙本质的光传递研究，以及动物实验。