基于稳定同位素内标与SPE净化的高灵敏LC–MS/MS法测定巴氏杀菌乳中β-CM5及工业热处理影响

《Food Science & Nutrition》：A Sensitive LC–MS/MS Method for Quantifying Beta-Casomorphin 5 in Pasteurized Milk

本研究旨在应用高灵敏液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）法定量巴氏杀菌乳（PM）中β-酪啡肽5（β-CM5）含量，并评价热处理对该肽的影响。研究人员从当地超市采集商业PM样品，并对工业乳（IP）样品在62°C和72°C下进行5 min热处理。乳样品经固相萃取（SPE）净化，并采用LC–MS/MS结合稳定同位素标记内标分析β-CM5。该方法具有高灵敏度，检出限为0.03 ng/g。商业PM样品中β-CM5浓度为0.10–0.55 ng/g，IP样品为0.10–0.13 ng/g。结果表明，工业热处理对β-CM5影响很小，PM样品中该肽含量差异主要由原料乳来源差异（如内源性酶活性和β-酪蛋白含量）驱动，而非巴氏杀菌条件。

研究背景与问题：β-酪啡肽5（β-casomorphin 5，β-CM5；一种来源于牛β-酪蛋白（β-casein）的阿片五肽）可在乳加工尤其是奶酪制作过程中释放，也可在肠道内由二肽基肽酶-IV（DPP-IV）从β-酪啡肽7（β-CM7）释放。β-CM5对μ-阿片受体（μ-opioid receptors）的亲和力高于β-CM7。已有研究较多关注β-CM7的潜在健康影响，而β-CM5与人体健康关系的研究较少；流行病学提示β-CM5可能与婴儿呼吸暂停相关，但体外和离体研究证据尚不充分且不确定。乳制品中β-CM5的存在仍有争议，且取决于分析方法灵敏度：Sienkiewicz-Sz?apka et al.应用酶联免疫吸附测定（ELISA）曾检出奶酪中0.05–3.14 μg/g，而De Noni and Cattaneo用LC–MS/MS在多种奶酪中未检出，后续又在Gorgonzola、Bergader和Stilton奶酪中检出；液体乳中Nguyen et al.用LC–MS/MS在原料乳中定量到0.0–0.64 ng/g，但巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳中未检出。已有研究未报道PM中β-CM5的存在及商业热处理对该肽含量的影响。因此，研究人员旨在应用高灵敏方法鉴定和定量PM中β-CM5，并考察工业热处理后β-CM5浓度变化；通过LC–MS/MS结合同位素氘代内标和SPE净化建立优化方法。研究结论显示，PM中可检出β-CM5，工业热处理对其影响很小，不同PM样品间含量差异主要与原料乳来源（如内源性酶活性和β-酪蛋白含量）有关，而非巴氏杀菌条件；该法灵敏度高，具有作为乳制品β-CM5测定“金标准”方法的潜力，为PM中β-CM5出现提供了新见解。

关键技术方法：研究人员采集西澳大利亚当地超市五个品牌商业全脂PM样品（来自五个乳品加工厂），并由乳品加工商提供原料乳及62°C/5 min、72°C/5 min工业热处理IP样品（样本队列来源：西澳大利亚商业PM与工业IP）。关键技术包括稳定同位素标记内标β-CM5-d₁₀（[²H₁₀] β-CM5）校正、固相萃取（SPE）净化，以及超高效液相色谱（UHPLC）–三重四极杆质谱（LC–MS/MS）多反应监测（MRM）正离子模式定量，并以保留时间和离子比进行鉴定。

研究结果：
3.1 LC–MS/MS Analysis for Beta-Casomorphin 5：研究人员建立LC–MS/MS-MRM方法，监测β-CM5两个离子对并用保留时间和离子比鉴定；线性R²=0.9997，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.03和0.11 ng/g，低于既往方法。所有乳样MRM比为35.01–45.49，在允许范围31.80–53.00内，保留时间偏差0.12%–0.30%，样品与内标保留时间绝对差0.00–0.02 min，证明PM中存在β-CM5。通过方法学验证得出该法灵敏、可靠。

3.2 Beta-Casomorphin 5 in Pasteurized Milk：五个商业PM样品均检出β-CM5，含量存在差异，PM5为0.10 ng/g?3–0.95×10^?3 μmol/L），低于生物测定研究报告的IC₅₀阈值，且既往体外胃肠消化研究显示β-CM5不由消化产生，提示日常PM消费不太可能触发阿片活性。IP样品中原料乳为0.11 ng/g，62°C/5 min和72°C/5 min热处理后分别为0.13和0.10 ng/g，表明工业热处理对β-CM5影响很小。研究人员据此认为，PM中β-CM5可能由原料乳带入、内源酶释放或产品储存/热处理中细菌外源酶形成；但本研究中原料乳来自健康牛群并立即热处理、冷链短时运输，原料乳中β-CM5更可能源于纤溶酶和组织蛋白酶等内源蛋白酶水解β-酪蛋白，而非细菌外源酶；五个品牌差异更可能归因于乳源β-酪蛋白含量和内源酶活性差异，而非巴氏杀菌条件。

讨论部分总结：讨论指出，巴氏杀菌用于灭活酶和病原微生物以延长货架期，但纤溶酶、组织蛋白酶D及假单胞菌属细菌蛋白酶可能未被完全灭活，热处理还可导致蛋白修饰；理论上美拉德反应自由基可影响蛋白骨架而释放肽，但本研究IP样品结果不支持工业巴氏杀菌释放β-CM5，并与Nguyen et al.的报道一致。研究局限包括未独立评估β-CM5绝对提取回收率及其在冻干和?20°C储存中的稳定性；虽然同位素内标可补偿后续提取和LC–MS/MS损失，但不能排除加内标前变化；每个品牌仅一个样品，重复为同一均质冻干粉的分析重复而非独立生物学或批次重复，未评估批间变异。

研究结论翻译：LC–MS/MS与稳定同位素标记内标及SPE净化的结合为定量PM中β-CM5提供了高度可靠的分析方法，这些联合技术有潜力作为测定多种乳制品中β-CM5的“金标准”方法。总体而言，本研究为PM中β-CM5的出现提供了新见解，并证明巴氏杀菌处理不太可能释放β-CM5；不同乳品牌PM样品间β-CM5含量差异可能归因于原料乳来源差异。未来应进一步研究原料乳β-酪蛋白谱和内源性活性等因素，以充分阐明乳制品中β-CM5含量的调控机制。然而，本研究的局限性在于未独立评估β-CM5绝对提取回收率及其在样品冻干和?20°C储存期间的稳定性；尽管使用同位素标记内标补偿后续提取和LC–MS/MS分析中的潜在损失，但不能排除加入内标前β-CM5发生的潜在变化；此外，每个乳品牌仅评估一个样品，重复为来自同一均质冻干粉的分析重复而非独立生物学或批次重复，因此未评估同一品牌内的批间变异性。