基于蛋白质组学与代谢组学的前列止痛方经BCAT2/ALDH轴抑制铁死亡治疗慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的机制研究

《Chemical Biology & Drug Design》：Mechanism of Qianlie Zhitong Formula Against Chronic Prostatitis Based on Proteomics and Metabolomics

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）是男性常见的盆腔疼痛疾病，但有效药物治疗仍有限。新近证据提示，氧化应激和铁代谢失调参与CP/CPPS发病机制，铁死亡日益被认为与CP/CPPS相关病理有关。前列止痛方（QLZTF）在治疗CP/CPPS中显示出治疗潜力；然而其潜在机制仍未完全阐明。本研究整合蛋白质组学、代谢组学和体内实验以探究QLZTF的治疗机制。建立角叉菜胶诱导的大鼠模型，并将大鼠随机分为五组：对照组、模型组、前列康组、低剂量QLZTF组和高剂量QLZTF组。QLZTF显著降低炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β），缓解疼痛反应，并改善前列腺组织损伤。蛋白质组学分析鉴定BCAT2、ALDH1B1和ALDH2为与铁死亡密切相关的显著上调蛋白。对蛋白质组学和代谢组学数据的KEGG富集分析显示，泛酸和辅酶A（CoA）生物合成及支链氨基酸（BCAA）降解途径显著富集。整合分析表明，QLZTF协同调控这些通路，激活BCAT2/ALDH轴，并抑制铁死亡，从而减轻CP/CPPS中的炎症、疼痛和纤维化。本研究首次为QLZTF的抗铁死亡机制提供多组学证据。

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS，主要对应NIH III型前列腺炎）占前列腺炎约90%–95%，以盆腔疼痛、排尿症状和性功能障碍为主要表现，病程慢性复发，常导致心理困扰和生活质量下降。临床虽使用非甾体抗炎药、神经调节剂、α受体阻滞剂、抗生素、植物药、盆底治疗及多模式策略，但其发病机制和最佳治疗仍未完全阐明；血-前列腺屏障和异质性炎症微环境还可能限制药物递送与疗效。QLZTF是基于复元活血汤（FYHXD）治疗原则开发的经验方，FYHXD见于《医学发明》，传统用于外伤相关血瘀疼痛；现代临床观察提示改良FYHXD对NIH-III前列腺炎和慢性非细菌性前列腺炎有较好疗效，可改善NIH-CPSI评分、尿路症状、生活质量及前列腺按摩液中IL-8、IL-10、TGF-β1等炎症/免疫介质，但QLZTF干预CP/CPPS的蛋白质组学和代谢组学机制尚不充分。近期机制研究提示CP/CPPS与炎症、氧化应激、代谢扰动及铁死亡相关病理改变有关。研究人员据此假设QLZTF可调控铁死亡相关炎症和代谢网络，并联合UPLC–MS（超高效液相色谱–质谱）成分分析、蛋白质组学、非靶向代谢组学和关键铁死亡分子验证开展研究。研究结论为QLZTF可降低炎症细胞因子、缓解疼痛和改善前列腺组织损伤；多组学显示其协同调控泛酸/CoA生物合成和BCAA降解通路，激活BCAT2/ALDH轴并抑制铁死亡，从而减轻CP/CPPS炎症、疼痛和纤维化。该研究首次提供QLZTF抗铁死亡机制的多组学证据，为临床应用和中药复方多组学研究提供实验基础与范式。

关键技术方法概括：研究采用40只雄性Sprague–Dawley大鼠（180–200 g，购自Sibeifu Biotechnology Co. Ltd.，实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准），以双侧腹侧前列腺内注射1%角叉菜胶建立CP/CPPS模型，随机分为对照、模型、前列康（0.5 g/kg·d）、QLZTF低剂量（1.7 g/kg·d）和高剂量（6.8 g/kg·d）组，连续4周后取材。技术包括UPLC–MS成分分析、DIA（数据非依赖采集）蛋白质组学、UHPLC–Orbitrap Exploris 480非靶向代谢组学，以及ELISA、H&E染色、GPX4免疫组化、von Frey纤维疼痛行为测试和Western blot验证。

结果部分：3.1 鉴定QLZTF主要生物活性成分（UPLC–MS分析）：UPLC-MS/MS鉴定36个入血成分，来源于Linderae Radix、Persicae Semen、Carthami Flos、Sargentodoxae Caulis、Corydalis Rhizoma、Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix和Bupleuri Radix，代表性成分包括linderane、amygdalin、hydroxysafflor yellow A、chlorogenic acid、dehydrocorydaline、polydatin、saikosaponin A/D等，说明QLZTF含多种可入血化学成分。3.2 QLZTF在CP/CPPS大鼠中的体内治疗效力：3.2.1 总体实验设计与基础指标：五组体重呈稳定线性增长，第0周约360 g、第4周约510 g，组间无统计学差异。3.2.2 QLZTF降低前列腺组织促炎细胞因子水平：ELISA显示模型组TNF-α、IL-6、IL-1β显著升高，QLZTF有效抑制其上调。3.2.3 H&E和IHC染色前列腺组织病理学发现：H&E示模型组血管扩张充血、腔内分泌物减少、腺泡腔狭窄、腺泡上皮乳头状增生、间质水肿伴纤维化和广泛淋巴细胞浸润；QLZTF组多数腺腔结构完整，但上皮排列不规则、基底膜内陷，间质少量炎症细胞浸润。IHC示模型组GPX4表达明显降低，QLZTF低、高剂量均恢复GPX4表达。3.2.4 疼痛反应测量（von Frey纤维）：第0周4 g刺激下模型及相关组反应频率显著升高；4周后QLZTF和前列康组反应频率显著降低（p<0.01），QLZTF高剂量约45%，接近对照约35%，低、高剂量间无显著差异。3.3 蛋白质组学揭示QLZTF上调BCAA代谢和CoA生物合成通路抑制铁死亡：蛋白质组学PCA显示组间分离；QLZTF组相对模型组鉴定241个上调、642个下调差异表达蛋白（DEPs）；KEGG富集显示泛酸和CoA生物合成及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路显著富集，BCAT2、ALDH1B1、ALDH2显著上调；另富集内质网蛋白加工、色氨酸代谢和脂肪酸降解通路，提示与铁死亡和氧化应激相关。3.4 代谢组学证实BCAA和CoA生物合成通路参与QLZTF的治疗效应：代谢组学PCA显示QLZTF组与正常组、模型组分离；OPLS-DA为R²=0.773、Q²=0.373；鉴定15,427个代谢物、1,449个可明确匹配，QLZTF与模型组间436个差异代谢物，火山图进一步显示84个上调和41个下调；KEGG富集显示泛酸和CoA生物合成及BCAA降解通路显著富集，鞘脂代谢（p=0.03）和甘油磷脂代谢（p=0.05）亦富集，提示两条通路为关键代谢枢纽。3.5 Western blot验证关键蛋白：ALDH1B1在模型组较对照组显著降低（p<0.01），QLZTF高剂量和前列康均上调其表达，QLZTF高剂量高于前列康（p<0.05），与蛋白质组学结果一致。

讨论部分总结：讨论整合蛋白质组学和代谢组学，认为泛酸/CoA生物合成与BCAA降解通路是QLZTF治疗CP/CPPS的核心代谢枢纽。BCAA不仅参与蛋白合成，还调节能量代谢、氧化应激和免疫炎症反应；BCAA代谢失调可促进铁死亡，促进BCAA代谢则可抑制铁死亡；BCAA代谢物β-氨基异丁酸可激活AMPK/Nrf-2通路，上调GPX4和SLC7A11。泛酸是CoA合成前体，CoA参与100余种酶反应、能量和脂质代谢以及炎症介质合成与解毒。QLZTF上调的BCAT2、ALDH1B1、ALDH2为关键抗铁死亡效应蛋白：BCAT2通过调节谷氨酸-胱氨酸交换促进半胱氨酸消耗、减少ROS积累；ALDH1B1催化有毒醛（如4-羟基壬烯醛）氧化；ALDH2通过解毒醛、生成NADH、调节pH和促进脂滴形成发挥抗铁死亡作用，与Lin et al.关于铁死亡参与慢性前列腺炎进展的报道一致。讨论还涉及内质网蛋白加工、色氨酸代谢、脂肪酸降解、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢等通路，并与QLZTF降低TNF-α、IL-6、IL-1β及疼痛反应、改善组织病理的药效结果相呼应。成分层面，Carthami Flos中的hydroxysafflor yellow A具有抗炎抗氧化作用并可抑制Toll样受体4通路，Bupleuri Radix中的saikosaponin D可抑制NF-κB通路、缓解慢性前列腺炎小鼠盆腔疼痛和前列腺炎症；文献还提示hydroxysafflor yellow A可经HIF-1α/SLC7A11/GPX4通路抑制铁死亡，saikosaponin A可调节GPX4和ACSL4等铁死亡相关蛋白。研究结论翻译：总之，本研究首次证明QLZTF协同调控泛酸/CoA生物合成和BCAA降解通路以激活BCAT2/ALDHs轴，有效抑制铁死亡，从而减轻CP/CPPS中的炎症、纤维化和疼痛。该“通路—代谢—铁死亡”机制的阐明不仅为QLZTF临床应用提供实验依据，也为中药复方多组学研究提供范式。未来采用基因敲除/过表达和细胞热转变分析（CETSA）等技术的研究有必要进一步验证QLZTF特定活性成分与BCAT2、ALDH1B1和ALDH2之间的直接相互作用。