近红外光谱联合机器学习无创监测关节外植体共培养炎症反应及基质相关生物标志物

《Osteoarthritis and Cartilage》：Optical monitoring of inflammatory response in joint explant cultures using near infrared spectroscopy

　　

目的：评估近红外（NIR）光谱联合机器学习（ML）用于检测和估计外植体模型培养基中释放的炎症及基质相关生物标志物的能力。材料与方法：将牛骨软骨外植体和滑膜组织在模拟骨关节炎（OA）的炎症因子处理（IF-treated）条件与非IF处理条件下共培养。共培养维持7天，每日收集并更换培养基。样品进行NIR光谱测量（900–1700 nm），随后测定释放至培养液中的硫酸化糖胺聚糖（sGAG）、一氧化氮（NO）、白细胞介素（IL）-6和IL-8。采集光谱经预处理后，采用基于ML的模型进行分类和生物标志物估计分析。进行特征重要性分析以识别有助于生物标志物分类和预测的关键波长特征。结果：与非IF处理设置相比，OA样设置中生物标志物释放显著增加。分类过程中，IF处理与非IF处理光谱呈现不同模式，在1440–1520 nm和1600–1700 nm区域差异明显。利用这些光谱差异，性能最佳的分类器在区分OA样样本与非IF处理样本时达到95.3%的准确率。回归分析亦显示良好回归性能，sGAG、NO、IL-6和IL-8的R²值分别为0.44、0.48、0.42和0.36。结论：本研究表明，NIR光谱联合ML可检测并定量外植体培养基中与OA相关的光谱特征，从而证明其作为非破坏性、快速监测离体OA模型炎症活动方法的潜力。

Nithin Sadeesh等围绕近红外光谱（NIR spectroscopy；一种非破坏性光学技术，可反映样品吸收或散射光的信息）联合机器学习（ML；基于算法从数据中学习模式）监测关节外植体共培养炎症反应开展研究。研究背景方面，慢性关节疾病如骨关节炎（OA；以关节软骨进行性降解为特征的慢性关节疾病）以关节软骨进行性降解为特征，全球近6亿人受累，是疼痛、残疾和生活质量下降的重要来源，且OA进展的病理生理仍未完全阐明。炎症在关节破坏和OA进展中具有关键作用，炎症因子（IFs）如IL-1β和肿瘤坏死因子α（TNF）可诱导软骨细胞表达基质金属蛋白酶（MMPs）等软骨降解酶，IL-1β、TNF和IL-8产生增加提示炎症活跃。离体OA模型可提供受控平台研究软骨炎症和基质退化，但实时监测炎症微环境至关重要，因为终点测量不能纵向捕捉炎症和组织降解过程中的动态生物标志物变化；已有电化学NO监测、温度激活近红外荧光与表面增强拉曼散射、葡萄糖和乳酸生物传感器等探索，NIR光谱联合ML也已用于OA软骨结构组成、滑液诊断及工程软骨形成中透明质酸、总胶原和乳酸释放监测。基于此，研究人员假设NIR光谱可用于测量释放至培养基中的炎症生物标志物，并在牛外植体模型中验证。研究结果表明，NIR光谱联合ML可检测和定量培养基中OA相关光谱特征，分类准确率最高95.3%，回归R²中等（sGAG 0.44、NO 0.48、IL-6 0.42、IL-8 0.36），显示其作为非破坏、快速监测离体OA模型炎症活动的潜力；其意义在于单次光谱测量可快速多重评估，较传统分别耗时测定可减少实验时间、人工和成本，为实时监测OA相关生化活动提供基础。

关键技术方法（不超过250字）：牛膝关节来源于当地屠宰场（Metzgerei Angst AG, Zurich, Switzerland）屠宰后48小时内，供体为1–2岁小牛；研究纳入5名健康雌性生物学供体，每供体8–12个共培养重复，每处理条件14个共培养重复，共56个共培养，7天共获得392份培养基样本和3920条光谱。方法包括牛骨软骨与滑膜组织共培养、IF处理与非IF处理7天每日收集培养基、900–1700 nm NIR透反射光谱测量、sGAG/NO/IL-6/IL-8参考测定、活/死染色组织活力评估，以及按供体分层的蒙特卡洛交叉验证用于ML分类、回归和排列特征重要性分析。

研究结果如下。1. 培养期间组织活力：通过7天培养后活/死染色与荧光/共聚焦显微评估，滑膜第0天活力91.8±0.9%，7天后各条件仍高（LG 94.0±2.3%、LG+IF 94.2±3.1%、HG 93.1±5.6%、HG+IF 95.4±4.1%）；软骨7天后活力为LG 86.8±8.7%、LG+IF 80.4±13.4%、HG 98.2±1.3%、HG+IF 97.5±1.6%，较厚（>1500 μm）外植体深层软骨死亡较多，较薄外植体各条件活力较高；结论为培养条件总体维持软骨和滑膜高活力，但LG条件下较厚软骨活力降低。2. sGAG释放定量：通过比色参考测定和线性混合效应模型（REML）分析，sGAG释放受处理（p<0.0001）、培养时间（p=0.0006）及处理×时间交互（p<0.0001）显著影响；非IF组第1–5天下降后稳定至第7天，IF组持续较高，LG+IF中度下降，HG+IF第3–5天升高后平台；结论为IF处理提高sGAG释放，提示基质降解。3. 炎症介质NO、IL-6和IL-8测定：通过Griess法、酶联免疫吸附测定（ELISA）及REML分析，NO、IL-6、IL-8均受处理（均p<0.0001）、时间（p<0.05）及交互（均p<0.01）显著影响；非处理组NO和IL-6第1天最高后下降，IL-8略降但HG组第6–7天回升；IF组总体高于非处理组，LG+IF的NO下降而HG+IF维持，IL-6在LG+IF稳定、HG+IF略升，IL-8在LG+IF下降、HG+IF稳定；结论为IF处理增强炎症介质释放。4. IF处理与非IF处理条件下培养基变化：通过比较平均NIR光谱，非IF类（HG和LG）与IF类（HG+IF和LG+IF）光谱轮廓不同，差异主要在1440–1520 nm和1600–1700 nm；结论为条件培养基NIR光谱含炎症刺激相关差异。5. IF处理与非IF处理类别的光谱分类及特征重要性：通过基于3920条光谱的按供体蒙特卡洛交叉验证，在标准正态变量变换（SNV）、Savitzky–Golay（SG）滤波、标准化和主成分分析（PCA）预处理下，直方图梯度提升（HGB）分类器在独立供体测试集达到95.3%准确率、精确率和召回率95.27%、F1 95.26%，对非IF特异性95%、对IF敏感性95.6%；特征重要性显示1150–1200 nm、1280–1320 nm、1650–1750 nm（表列还包括1500–1520 nm）影响较大；结论为NIR光谱可高准确区分IF处理与非IF处理培养基。6. 生物标志物释放的ML预测及特征重要性：通过随机森林（RF）回归和排列特征重要性，sGAG（R²=0.44，皮尔逊相关系数（PCC）=0.70）、NO（0.48，0.73）、IL-6（0.42，0.66）、IL-8（0.36，0.60）获得中等预测；sGAG相关特征为1150–1185和1210–1230 nm，NO为1000–1110、1150–1160、1430–1445和1490–1550 nm，IL-6为1000–1015、1210–1245、1315–1325、1380–1415和1490–1500 nm，IL-8为915–920、1395–1410和1650–1660 nm；结论为NIR可对多种生物标志物进行中等精度定量，特征区域涉及O–H、C–H、N–H等振动。

讨论部分总结：研究人员指出，培养条件总体维持高活力，但LG较厚软骨活力降低；sGAG和NO在非处理培养中随时间下降，而IF处理特别是HG条件下升高并持续，提示软骨基质降解和炎症/分解代谢激活，IL-6和IL-8升高确认炎症通路激活。由于HG和LG合并为IF和非IF大类，部分光谱分离可能反映代谢和炎症综合效应而非单纯炎症；NO本身无强NIR吸收，通过其与蛋白和水相互作用的间接生化效应检测。按供体验证减少数据泄漏，但供体数少限制泛化，结果应视为概念验证；R²中等可能与外植体生物变异和检测灵敏度有限有关，尤其IL-8；IL-6和IL-8参考数据较少（n=50、n=48）及IL-8浓度分布不均可能降低预测性能；透明质酸等其他可溶性成分可能贡献光谱，未来可纳入生物标志物组合并开展加标实验。研究结论翻译：本研究表明，NIR光谱联合ML提供了一种非破坏性方法，用于监测培养基中与基质降解和炎症相关的炎症细胞因子及生物标志物。条件培养基NIR光谱捕获了生物标志物特异性吸收趋势，能够准确识别在OA样条件下培养的样本，并支持对这些生物标志物进行中等精度的定量。与传统需分别、耗时测量每种分析物的方法相比，基于NIR的方法通过单次测量实现快速、多重评估，显著减少实验时间、人工操作和总体成本。总之，该方法为快速、经济有效且实时监测与OA相关的生化活动提供了有前景的基础。