单核细胞单层试验的标准化：从实验室优化与文献回顾中获得的经验教训

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Standardization of the Monocyte Monolayer Assay: Lessons Learned From Laboratory Optimization and Literature Review

　　

摘要 目的：多项变量可影响细胞学检测的结果。研究人员开展了一项全面的文献回顾，以识别影响单核细胞单层试验（Monocyte Monolayer Assay, MMA）的因素，并通过系统的实验室内部试验对该试验进行了标准化。 方法：研究分两个阶段进行。第一阶段利用PubMed和Scopus数据库进行文献回顾，以识别影响该试验的因素。第二阶段开展实验性试验，以评估这些因素的影响。研究人员从白膜层血袋（buffy coat bags）中分离单核细胞，并对试验参数如离心速度、单核细胞贴壁条件、红细胞致敏、孵育时间及染色进行了系统标准化。玻片判读采用盲法评估，以判断操作流程因素对试验可靠性的影响。 结果：利用PubMed和Scopus数据库进行的文献回顾识别出影响MMA性能的关键变量。共进行了十二次连续试验，以确定这些变量对试验结果的影响。最佳离心速度和时间为600 × g离心15 min，使用四个白膜层血袋可将单核细胞产量提高至8.3 × 106/mL。使用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline, PBS，pH 7.2）稀释并使用Histopaque可获得稳定的细胞回收率。1 h孵育可获得最佳单核细胞贴壁效果且细胞裂解最少。最终方案显示出高重复性，并改善了吞噬作用的可视化效果。 结论：本研究强调了在实施MMA前进行标准化的重要性。优化各项参数以确保提高单核细胞产量、减少细胞裂解，并实现可靠判读以评估红细胞同种抗体的临床意义，至关重要。

单核细胞单层试验的标准化研究解读

一、研究背景与意义

对于携带高频红细胞抗原抗体的患者、自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia, AIHA）伴有自身抗体或自身抗体合并同种抗体的患者，以及抗体临床意义不明的患者，输血支持具有较大挑战性。输血后发生溶血的风险以及输入红细胞的体内存活情况难以预测。目前已有体内和体外方法用于预测溶血及红细胞存活情况。体内方法包括铬-51（Cr⁵¹）标记法、生物素标记法以及生物学交叉配血试验，但鉴于红细胞抗体临床意义不明，患者存在发生溶血的风险。体外方法包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）、化学发光试验以及单核细胞单层试验（MMA），这些方法可在红细胞输注前帮助预测抗体的临床意义。

在体外试验中，MMA是应用最广泛的用于判断红细胞抗原不规则抗体临床意义的体外方法，首个相关研究于1980年发表，使用人单核巨噬细胞开展。尽管该方法在文献中已有40余年的描述，但仍属于较少开展的检测项目，仅少数中心成功实现了标准化。主要挑战在于影响该试验的变量众多，使其成为一个复杂、多步骤且需要仔细优化的流程。这些步骤对于确立试验的可信度、减少误差以及确保临床决策的一致性至关重要。已有研究对试验变量进行了探讨，发现MMA可在ACD抗凝的全血样本上可靠进行，样本在室温下可保存长达36 h，前提是整个试验过程中维持生理性pH。为确保结果可靠，有研究提出建立经证实的单核细胞反应性志愿者库。当需要更高的单核细胞产量以评估患者血清与多个供者单位以选择最佳匹配血液单位时，仔细考虑试验相关变量至关重要。研究人员在使用同种异体细胞来源标准化MMA的过程中观察到，多个分析前、分析中和生物学因素显著影响试验性能和判读。因此，本研究回顾了现有文献，以识别影响MMA结果的关键变量，从而判断AIHA患者红细胞抗体的临床意义。

二、研究设计与主要技术方法

本研究经机构伦理委员会批准后历时6个月（2023年1月至2023年6月）完成，最终方案已提交印度政府进行版权登记。研究分两个阶段开展。第一阶段为结构化叙述性文献回顾，在PubMed和Scopus数据库中以"monocyte monolayer assay"为关键词进行检索，限定为近10年内发表的英文期刊文章，对不同研究中的单核细胞分离、红细胞制备和试验执行方法进行了比较分析。第二阶段为重复性试验，评估关键因素的影响，最终形成了结果最可靠的试验方案。单核细胞来源于献血者全血成分分离后获得的白膜层血袋，采用密度梯度离心法分离，以RPMI 1640培养基重悬后加入8孔培养板中贴壁。阳性对照采用IgG抗D致敏的O Rh D阳性红细胞，阴性对照为未致敏的健康供者红细胞，试验样本为AIHA患者血清。通过Leishman染色后在显微镜下计数300个单核细胞，计算发生红细胞吞噬或黏附的单核细胞百分比，以5%作为阳性判定阈值。为减少偏倚，试验操作与结果验证由不同人员完成，并对玻片进行唯一编号以实现盲法评估。

三、主要研究结果

3.1 第一阶段：文献回顾结果

文献回顾显示，大多数已发表的MMA操作方案均是对Gallagher等和Branch等最初方法的改良。不同技术在单核细胞来源、温度条件、分离用试管规格、密度梯度介质选择、离心机类型、稀释方式、培养基、孵育时间、涂片制备平台以及计数方法等方面均存在显著差异。这些差异凸显了标准化的必要性，以确保结果的一致性和可靠性。

3.2 第二阶段：试验优化结果

研究人员共进行了12次连续试验以优化MMA性能。试验I至III显示，使用白膜层血袋作为单核细胞来源时，因离心参数不当导致血袋鼓胀、试管变形、单核细胞层形成不良及产量不足（0.25 × 10⁶/mL）。试验IV将白膜层血袋增加至四个并使用Ficoll Hypaque作为密度梯度介质，单核细胞产量提高至9 × 10⁶/mL，但操作繁琐且周转时间长达6至8 h。试验V尝试直接使用Histopaque分层但未形成清晰的单核细胞层。试验VI将白膜层与PBS按1:1稀释后加于Histopaque之上，成功获得8.3 × 10⁶/mL的单核细胞计数，周转时间缩短至2至3 h。试验VII和VIII建立了标准化的RPMI 1640培养基制备方法。试验IX采用24 h孵育导致细胞裂解、涂片质量差和过度染色。试验X将孵育时间缩短至1 h后，直接抗球蛋白试验（DAT）阳性强度为2+，样本制备得到验证。试验XI比较了1 h和24 h孵育时间，24 h导致溶血增加，而1 h孵育因裂解减少而获得更好的可视化效果。试验XII使用AIHA患者血清进行最终验证，两名操作人员分别计数300个单核细胞获得相似的单核细胞指数，证实了方案的重复性。

最终优化方案为：汇集四个白膜层单位，取25 mL白膜层与25 mL PBS加入50 mL离心管中；取4 mL密度梯度介质与等体积稀释样本加入15 mL离心管，600 × g离心15 min分离单核细胞层；提取的单核细胞层用PBS在400 × g离心10 min洗涤；最终单核细胞层与RPMI 1640培养基混合，浓度维持在3至6 × 10⁶ cells/mL；向8孔培养板每孔加入200 μL单核细胞，37°C孵育1 h；随后每孔加入200 μL试验样本，37°C孵育1 h；小心吸弃上清并移除腔室，用生理盐水缓慢冲洗三次；依次加入Leishman染液和缓冲液各孵育2 min和10 min；最后用蒸馏水洗涤并风干后镜检。整个试验过程中维持pH 7.3。

患者临床特征方面，受试患者平均年龄47岁（范围23至72岁），包括两例女性和三例男性。DAT阳性，间接抗球蛋白试验（IAT）显示全凝集无特异性模式，提示AIHA且无潜在同种抗体。外周血涂片可见球形红细胞提示溶血，间接胆红素和乳酸脱氢酶（LDH）升高，平均血红蛋白为5.6 g/dL，平均红细胞压积为18.96%。

四、讨论与结论

尽管MMA已建立多年，且对判断红细胞抗原抗体的临床意义具有重要价值，但在常规实践中的应用仍不及间接抗球蛋白试验（IAT）等传统血清学方法广泛。这种有限的应用主要归因于该试验的技术复杂性、耗时性以及对专业技术的需求。文献中各方案在细胞学试验的每个步骤均存在相当大的变异性。试验最关键环节为单核细胞分离，文献中获取来源的方式差异较大。自体单核细胞是判断红细胞抗体临床意义的首选，但在参考实验室中并不总是可行。同种异体单核细胞比自体单核细胞更常用，其来源为外周血，体积从2至50 mL不等。白膜层来源的单核细胞也被研究用于冷冻保存，其功能特性可保持长达6个月。

本研究采用同种异体单核细胞来源，汇集健康献血者的白膜层以增强单核细胞效能并减少供者间变异性。由于白膜层单位在血小板浓缩物分离后通常被废弃，可用于MMA而无需额外采集献血者样本。文献表明，枸橼酸盐抗凝剂比EDTA更有利于单核细胞分离，本研究选择枸橼酸盐是因为采集袋中即含有枸橼酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD）抗凝剂。红细胞与单核细胞的黏附及随后的吞噬是Fcγ受体介导吞噬的连续阶段。由于该体外试验是体内连续过程的固定点替代方法，若仅评估吞噬作用，产生强FcγR黏附但尚未完成吞噬的抗体可能被错误判读为阴性。本研究同时考虑黏附和吞噬来计算单核细胞指数以提高敏感性。整个试验从单核细胞分离到吞噬评估的总周转时间约为8至12 h。

已有文献指出，二氧化碳环境单独或与缓冲液联合使用对维持MMA中的pH至关重要。但本方案在不使用5% CO₂的情况下仍能较好维持pH，可能归因于CPD抗凝剂的使用、RPMI培养基以及较短的孵育时间。24 h孵育导致更多溶血和较差的镜下形态，缩短至1 h孵育则在重复试验中保持一致的贴壁质量且裂解最少。已有研究指出8孔腔室玻片优于24孔培养板，后者背景中存在大量未吞噬的红细胞；Leishman染色优于Giemsa染色，能更好地区分红细胞、单核细胞和吞噬空泡。本研究同样使用8孔培养板和Leishman染色，有助于同时观察黏附和吞噬。

已有研究强调了两阶段补体致敏技术的应用，验证了MMA在向同种免疫患者安全输注抗原阳性血液方面的价值；也有研究利用明胶包被孔和Leishman染色分析单核细胞活性，为MMA判断自身抗体的临床相关性提供了证据；还有研究探索了白膜层单核细胞的冷冻保存，显示冻融后单核细胞回收率和膜完整性保持良好。另有研究强调了每次输血前进行MMA的重要性，尤其是在血清学不相容的红细胞病例中。使用血浆代替血清可改善补体激活抗体存在时的可判读性，因为血清中补体激活导致过度玫瑰花环形成，干扰吞噬评估。在镰状细胞病患者中开展MMA存在特殊挑战，建议使用氯化铵裂解自体红细胞以减少单核细胞分离过程中的污染，这凸显了针对特定患者群体和抗体类型调整方案的重要性。

本研究通过多次试验对AIHA患者自身抗体的MMA进行了标准化，建立了可重复的实验室内部方案。仔细评估对于细胞学试验的标准化至关重要，因为这些因素显著影响试验的重复性、可靠性以及结果的整体可判读性。该流程可能可推广至同种抗体，但在广泛应用前需仔细优化，因为本研究未对此进行评估。本研究的局限性在于，由于缺乏设施和资金，该方案未与ADCC等其他体外细胞学试验进行比较。