慢性肺部感染不损害囊性纤维化大鼠模型中慢病毒载体介导的基因转移

《Gene Therapy》：Chronic lung infection does not impair lentiviral vector gene transfer in a cystic fibrosis rat model

基因治疗为囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）肺病提供了有前景的策略，尤其适用于调节剂不适用基因型（modulator-ineligible genotypes）个体。然而，临床转化慢于预期。尽管CF基因治疗候选产品通常在临床前研究中显示高疗效，但迄今试验的所有产品均未能推进至I/II期之后，这引发了对当前临床前模型预测能力的疑问。一个促成因素可能是常用CF啮齿动物模型缺乏严重黏液阻塞性肺病，突出表明需要在更接近重现CF肺环境的条件下评估基因载体。在本研究中，研究人员在野生型和CF大鼠的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）肺部感染条件下，评估了携带萤光素酶（luciferase）报告基因的水疱性口炎病毒糖蛋白G（vesicular stomatitis virus glycoprotein G, VSV-G）假型慢病毒（lentiviral, LV）载体。在LV载体给药后第7天和第14天进行生物发光成像（bioluminescence imaging），以评估感染和非感染条件下的肺转基因表达（transgene expression）。第7天，铜绿假单胞菌感染动物与非感染动物之间的生物发光无显著差异（p = 0.537）。从第7天至第14天，非感染动物生物发光下降136倍（p < 0.0001），而感染动物下降7倍（p = 0.043）；显著的感染×时间交互作用（infection × time interaction）表明非感染对照的下降幅度更大（p = 0.024）。这些发现表明肺病状态可调节转基因表达和持续性，突出表明在更接近模拟CF肺环境的条件下评估基因治疗载体的重要性。

囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）肺病是CF患者住院和早死的主要原因。高效调节剂疗法可改善多数CF患者的临床结局，但约10%携带无义变异的患者因缺乏CFTR蛋白而无法从药物挽救中获益；另有“调节剂难治”者无可测量临床获益或因不可耐受副作用停药，需要替代治疗以限制肺病进展。基因添加治疗通过向气道细胞递送健康CFTR cDNA或mRNA恢复离子通道功能、正常化气道生理并防止肺功能下降。载体包括腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）、慢病毒（lentiviral, LV）载体及脂质纳米颗粒等非病毒载体。LV载体免疫原性较低，可转导分裂和非分裂细胞并稳定整合至宿主基因组，实现长期转基因表达；VSV-G是表征充分且临床批准产品中广泛使用的LV假型，可高滴度生产并浓缩。但VSV-G利用位于气道上皮基底侧的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）受体进入细胞，因此腔面递送需破坏紧密连接。CF气道基因治疗临床转化受限于疗效不足和未达预设终点，部分源于临床前模型不能准确重现CF肺环境。CF肺病进展伴随厚黏液、慢性细菌感染和持续过度炎症；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是关键病原，可形成生物膜，限制抗生素扩散并构成基因递送屏障。早期使用腺病毒（adenoviral, AdV）和AAV载体的CF基因治疗试验失败，回顾性归因于载体不能扩散通过黏稠CF痰。少数体内研究显示，铜绿假单胞菌感染可降低AdV基因转移；AAV在支气管败血鲍特菌感染野生型小鼠及铜绿假单胞菌感染表面活性蛋白敲除小鼠中受阻；Rejman等发现脂质体转染在感染小鼠中被完全阻断，而LV载体和聚乙烯亚胺/DNA复合物维持疗效，提示需逐一测试载体。研究人员已建立两种不自发肺感染的CF大鼠模型，并开发慢性铜绿假单胞菌肺感染方法；本研究在该模型中评估感染对VSV-G假型LV载体介导基因转移的影响。其意义在于在更接近CF肺环境的条件下评估载体性能，为临床转化提供依据。

研究人员采用2 × 2析因设计，按基因型（野生型或CFTR缺陷）和感染状态（无菌珠或铜绿假单胞菌珠）分组，在感染后第7天经支气管镜向右主支气管递送VSV-G假型LV-EF1α-3XFLAG-fLuciferase-T2A-eGFP载体，第7天和第14天行生物发光成像，终点取肺进行菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）评估和组织病理学检查。研究结论为：慢性铜绿假单胞菌感染不显著损害LV介导的基因转移；感染动物第7天转基因表达与无菌对照相当，而第14天感染动物信号下降约7倍、无菌对照下降136倍，感染×时间交互作用显著，提示感染减缓转基因表达随时间的下降；基因型总体效应不显著，感染对时间效应在CF和野生型间无显著差异；雌性生物发光总体高于雄性；肺细菌负荷与信号下降幅度无显著相关。该研究挑战了感染和炎症是CF肺气道基因转移主要屏障的长期假设，提示其他因素可能对既往基因治疗有限临床成功贡献更大，并支持进一步开发LV载体基因治疗，尤其针对CFTR调节剂不适用且可能发展为更晚期肺病者。

关键技术方法：研究使用Sprague Dawley野生型大鼠（n = 20；雌7、雄13）和CFTR敲除（CFTR knockout）大鼠（n = 20；雌13、雄7），平均26周（22–33周），按2 × 2析因每组n = 10、共40只；因CF大鼠繁殖能力有限按可得数量分队列进行，未随机分组且研究人员未设盲。铜绿假单胞菌株20844为黏液型、多黏菌素敏感株，原从CF患者肺分离，由Monash University提供；经支气管镜向右主支气管递送50 μL含3 × 10⁴ CFU的菌珠或无菌珠，7天后递送LV载体（滴度4.7 × 10⁹ TU/mL，50 μL含2.4 × 10⁸ TU）；第7天和第14天行生物发光成像，终点取肺做CFU（每组n = 5）或组织病理（每组n = 5）。CF铜绿假单胞菌组一只雌鼠因CF相关胃肠梗阻退出，n = 9。动物实验经Adelaide University Animal Ethics Committee批准（M-2023-011）。

结果部分：肺部细菌负荷：感染后21天取肺匀浆计数CFU，CF大鼠肺部细菌负荷高于野生型（平均差1.62 log₁₀ CFU/g，约40倍），但未达统计显著（p = 0.11）；无菌珠组未检出铜绿假单胞菌。结论为野生型和CF大鼠在研究终点的肺部细菌负荷无显著差异。组织病理学：AB-PAS（Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff）染色显示，铜绿假单胞菌组野生型和CF大鼠均出现广泛肺泡实变、腔内黏液和血管周围套；无菌珠组总体较正常，仅见局灶肺泡实变。高倍镜下可见琼脂糖珠周围显著白细胞浸润及邻近肺泡淋巴细胞实变、泡沫巨噬细胞、气道杯状细胞增生、黏液完全阻塞气道腔、支气管周围和血管周围增厚伴细胞外基质和胶原沉积、致密淋巴细胞血管周围套、肺泡闭塞及诱导性支气管相关淋巴组织（inducible bronchus-associated lymphoid tissue, iBALT）增生；无菌珠组也可见偶发血管周围套、肺泡巨噬细胞簇、轻度支气管和血管周围增厚、偶发杯状细胞增生及气道和血管内蛋白样物质。结论为感染导致已建立肺感染的组织病理改变，且在野生型和CF大鼠中均明显。生物发光成像：第7天感染组与无菌组无显著差异（p = 0.537）；第14天无菌对照显著低于感染组（p = 0.0003）。无菌对照从第7天至第14天下降2.13 log₁₀ photons/sec（p < 0.0001），即136倍；感染组下降0.83 log₁₀ photons/sec（p = 0.043），约7倍；感染×时间交互作用显著（p = 0.024），表明感染减缓转基因表达下降。性别与生物发光显著相关（p = 0.016），雌性总体较高（估计边际均值6.09和5.31 log₁₀ photons/sec）。校正性别后基因型总体效应不显著（p = 0.077），基因型×感染×时间交互作用不显著（p = 0.49）。肺细菌负荷与第7天至第14天生物发光下降幅度无显著相关（p = 0.78）。结论为慢性铜绿假单胞菌感染不损害LV介导的基因转移，且感染动物转基因表达更持久。

讨论部分总结：作者指出，CF基因治疗从概念到临床转化困难，早期AdV和AAV试验未达CFTR mRNA检测、鼻电位差、肺功能（如FEV₁）或计算机断层扫描结构肺病等主要疗效终点，气道内在屏障和黏稠黏液对基因转移效率影响大于既往认识；细胞培养和健康动物肺的成功不足以支持临床转化，需在更接近CF肺环境的条件下评估。与Rejman等一致，铜绿假单胞菌感染不损害LV介导的初始基因转移；本研究中感染显著减缓第14天表达下降。作者提出可能解释：感染诱导气道损伤进一步破坏上皮完整性和紧密连接，增强LV进入基底干细胞龛；肺损伤刺激上皮修复和再生，基因修饰祖细胞增殖分化替代受损腔面细胞，从而改善转基因表达持久性；但细菌负荷与下降幅度无关，支持感染肺环境独立于细菌载量改变表达持续性；既往LPC（lysophosphatidylcholine）和物理扰动增强LV摄取和表达支持该假设。本研究首次使用CF动物模型评估肺感染对基因转移的影响。CF患者易感铜绿假单胞菌且清除受损；CFTR可能作为铜绿假单胞菌内化和清除受体，免疫细胞也表达CFTR。本研究中感染野生型和CF大鼠在感染后21天均有可检测细菌负荷，CF较高但无统计显著，可能与野生型组高变异有关；两者均有显著肺组织病理改变；未观察到野生型和CF大鼠感染建立或持续的显著差异，与近期在Phe508del和CFTR敲除大鼠中表征该菌珠模型的研究一致。感染和炎症肺递送基因治疗存在载体被已激活免疫系统快速清除或抗转基因免疫反应降低表达的风险，但本研究未观察到此现象；第7天表达相当，第14天感染组更高。AdV和AAV研究报道感染时表达显著降低，可能因细菌炎症作为佐剂增强抗载体免疫；LV免疫原性较低，可能更适合慢性炎症和免疫激活的CF肺。LPC用于感染肺未伴不良健康效应，脾培养无肺外细菌播散证据，与实验室未发表观察一致；尽管重复肺干预，未报告操作相关死亡或动物福利受损；提示气道表面条件化策略在感染肺的耐受性可能优于预期，支持临床转化可行性。局限性包括：CF大鼠繁殖限制导致性别分布不均，细菌和组织病理分析样本较小，无法充分校正性别，不能排除性别对部分结果的影响，但校正性别未改变生物发光分析中感染×时间交互作用的主要结局；铜绿假单胞菌菌珠模型不完全重现人CF肺感染，细菌被人工固定于琼脂糖珠可能改变细菌行为和宿主-病原互动，虽产生局部感染、强炎症和组织病理，但不反映CF肺病多微生物性质和复杂生物膜，且野生型和CF感染结局无显著差异可能提示模型过重并掩盖基因型差异；本研究仅评估一种基因治疗产品VSV-G假型LV载体在单一感染模型中的表现，外推至其他病毒或非病毒递送系统及更复杂人CF肺需谨慎；研究用胞内表达的萤光素酶作为CFTR替代物以量化LV介导基因表达，CFTR为复杂膜蛋白，需高度调控的翻译、折叠、加工和转运至顶膜，可能更易受感染诱导的细胞应激、炎症和蛋白质量控制影响，因此不能外推至治疗性CFTR的表达和功能；第14天后继续测量生物发光将有助于确定转基因表达在重塑肺环境中的变化及感染诱导优势是否持续。研究结论翻译：本研究表明，慢性铜绿假单胞菌感染的存在不显著阻碍LV介导的基因转移。有趣的是，细菌感染动物相比非感染对照表现出更持久的转基因表达，提示感染肺环境不损害LV介导转基因表达随时间的丢失，甚至可能减弱该丢失。这些发现挑战了长期假设，即CF肺内感染和炎症是气道基因转移的主要屏障，并提示其他因素可能对迄今基因治疗方法的有限临床成功贡献更大。此外，这项工作强调逐个评估每种基因治疗产品的重要性，因为载体性能在感染肺环境背景下可能显著不同。总体而言，这些数据为CF的LV载体基因治疗方法的进一步开发提供了临床前支持，尤其适用于不符合CFTR调节剂治疗资格、因而可能发展为更晚期肺病的个体。