遗传密码扩展（GCE）实现植物定向控制细菌活性：非经典氨基酸（ncAAs）编程植物–微生物互作

《Nature Biotechnology》：Genetic code expansion enables plant-directed control of bacterial activity

　　

以O-甲基-L-酪氨酸（OMY）作为模型化合物，研究人员将非经典氨基酸（ncAAs）确立为植物介导控制相关微生物活性的工具。研究人员利用遗传密码扩展（GCE）工程化改造土壤细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中OMY依赖的蛋白质合成。工程化B. subtilis菌株表达正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对（orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pair），在提供OMY时抑制靶转录本中的框内琥珀终止密码子（amber stop codons）。研究人员对拟南芥（Arabidopsis）、番茄（tomato）和杨树（poplar）进行工程化改造以生物合成OMY，表明植物来源的OMY可刺激模型土壤细菌和野生土壤细菌中的基因表达。这表明，植物对单一生物合成酶的诱导型和组织特异性表达能够实现对微生物活性的按需控制，从而将ncAAs确立为编程植物–微生物伙伴关系（plant–microorganism partnerships）的工具。

研究背景与意义：农业生产力在过去一个世纪显著提高，但推动增产的肥料、生长调节剂和农药作用广泛且常被过量施用，造成浪费和生态损害。具有向植物直接提供促生益处潜力的细菌被视为化学投入品的有前景替代方案，但有益微生物也可能扩散至目标作物之外，稀释目标作物原本获得的竞争优势并引发非预期生态变化。因此，需要一种机制将微生物益处限制在特定植物宿主和条件下。已有研究探索 rhizopines、opines、蔗糖和群体感应分子等植物产生信号控制细菌基因表达，但这些分子在跨界信号中的天然角色可能限制其在合成信号系统中的正交性。非经典氨基酸（ncAAs，超出经典翻译库的氨基酸）具有扩展工具箱的潜力；植物天然产生约250–300种ncAAs，而非天然ncCAs可结合遗传密码扩展（GCE，利用正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对将ncAA定点引入蛋白质的技术）编程植物–微生物互作。OMY被选为模型的原因包括：尚未在农业土壤中检测到，已知生物合成来源限于海洋Streptomyces spp.和稻瘟病菌Magnaporthe oryzae；可由来自Streptomyces drozdowiczii的O-甲基转移酶MfnG从L-酪氨酸单酶步合成；是首个在活细菌细胞中定点引入的ncAA且有稳健GCE机器；并可介导工程化Escherichia coli菌株间通信。研究人员据此建立OMY作为植物导向控制微生物行为的工具，证明模型土壤细菌B. subtilis可通过GCE将OMY引入目标蛋白，实现OMY依赖的蛋白合成；多种植物可通过单一生物合成酶异源表达合成OMY；植物来源OMY足以在共培养中控制细菌蛋白合成；系统可推广至多种靶蛋白并在野生细菌分离株中以最少优化发挥作用。该论文发表在《Nature Biotechnology》。
关键技术方法（≤250字）：研究采用GCE，在B. subtilis PY79及植物根际分离株UD1022中引入源自Methanocaldococcus jannaschii酪氨酰-tRNA合成酶（MjTyrRS）的napARS与抑制性tRNA^Tyr_CUA，以框内琥珀密码子（UAG）调控mNeonGreen、NanoLuc及sfp报告/靶基因；用液相色谱–质谱（LC-MS）定量OMY；在拟南芥Col-0稳定转基因、本氏烟（Nicotiana benthamiana）瞬时表达、番茄Heinz 1706与杨树INRA 717-1B4毛状根复合植株中表达MfnG；通过植物–细菌琼脂及灭菌土壤共培养、发光成像和流式细胞术检测细菌表达；用蛋白组学检测O-甲基化酪氨酸。土壤样本为Espoma有机盆栽土灭菌样品。
研究结果：
GCE in B. subtilis：研究人员将napARS和tRNA^Tyr_CUA引入B. subtilis PY79，并以含琥珀密码子的mNeonGreen报告基因检测OMY依赖蛋白生产，发现外源OMY呈剂量依赖激活，但单琥珀密码子存在明显背景荧光；改用NanoLuc并测试一或两个琥珀密码子后，双琥珀构建体背景显著降低，总倍数变化达3,100倍；将琥珀密码子引入sfp后，工程菌在无OMY时检测不到surfactin，在500 μM OMY时产生约0.18 g L^?1 surfactin，表明OMY依赖翻译可严密控制多种细菌蛋白表达。
Plant biosynthesis of OMY：研究人员在本氏烟叶片瞬时表达sfGFP–MfnG，并通过LC-MS检测到与OMY标准共洗脱的代谢物；随后用proUBQ10::sfGFP-MfnG转化拟南芥Col-0，转基因植株各组织表达sfGFP，水培条件下18株幼苗在12 ml培养基中48 h产生平均3.1 μM OMY，野生型对照未检测到OMY，表明植物细胞表达MfnG即可合成并分泌OMY。
Cocultivation of engineered plants and bacteria：研究人员将表达OMY依赖或非依赖NanoLuc报告基因的B. subtilis包埋于琼脂中，与拟南芥共培养并进行发光成像，发现OMY依赖发光仅出现在sfGFP–MfnG表达植株附近，峰值约高于中点强度3.2倍；OMY非依赖报告基因在各植株附近均显示约1.2倍小幅升高；野生型植株与OMY依赖菌株共培养时根部约1.4倍升高；转基因与野生型并排生长时发光集中在转基因植株周围，表明植物产生OMY可实现基因型特异性诱导细菌基因表达。
OMY effects on plant and bacterial growth：组成型表达sfGFP–MfnG的拟南芥表现主根长度缩短、侧根密度降低和向重力性受损；外源OMY对细菌生长速率无影响；外源OMY抑制野生型拟南芥主根长度的IC₅₀约为94–101 μM，比已知化感ncAAs如meta-tyrosine（IC₅₀为2.4 μM）和L-canavanine（IC₅₀约0.5 μM）弱约50–200倍；补充L-酪氨酸或L-苯丙氨酸未挽救生长表型；蛋白组学未检测到转基因植株中O-甲基化酪氨酸残基显著升高；组成型转基因种子萌发延迟、最终萌发率降低且活力下降更快，而外源OMY处理野生型种子对萌发影响很小，提示种子发育期OMY积累贡献适合度成本。
Conditional biosynthesis of OMY in planta：研究人员采用根冠特异性BRN1启动子和β-雌二醇诱导XVE系统表达sfGFP–MfnG；proBRN1::sfGFP-MfnG荧光仅限根冠，proXVE::sfGFP-MfnG在β-雌二醇处理24 h后强表达；两类条件表达植株主根长度、侧根密度、向重力性和萌发率均较组成型植株改善并接近野生型；proBRN1条件培养基检测到OMY（50株根冠特异幼苗12 ml中0.73 μM，低于组成型18株的3.1 μM）；流式细胞术显示mNeonGreen在0.05 μM OMY时诱导1.67倍、0.5 μM时诱导7.7倍；共培养中proBRN1植株激活OMY依赖NanoLuc约高于中点强度2.2倍；proXVE植株在20 μM β-雌二醇诱导下最大发光强度较未诱导提高约18.7倍，但峰/中点倍数变化不显著，表明条件性OMY生产在降低生长抑制的同时维持有效细菌控制。
Engineering OMY-dependent gene expression in a plant-growth-promoting bacterium：研究人员将相同GCE组件引入B. subtilis UD1022，该菌为可定殖拟南芥根部的野生分离株；UD1022显示与PY79相似的OMY剂量依赖mNeonGreen荧光；NanoLuc报告基因中单琥珀密码子变体在UD1022中效果最佳，倍数变化达111倍，而PY79以双琥珀密码子最佳；OMY不影响UD1022生长速率；在灭菌土壤中补充500 μM OMY后第3天UD1022中位荧光提高41倍；将UD1022与proUBQ10::sfGFP-MfnG植株在灭菌土壤中共培养3天后，OMY依赖mNeonGreen报告菌中位荧光为802 a.f.u.，野生型对照为530 a.f.u.，荧光群体由9.8%升至36.1%；琼脂共培养中UD1022发光模式与PY79相似且根尖最亮，表明OMY介导控制可扩展至野生土壤细菌并在琼脂和土壤环境中发挥作用。
Introducing OMY production to crop species：研究人员用Rhizobium rhizogenes介导的毛状根转化在番茄Heinz 1706和杨树INRA 717-1B4中表达proUBQ10::mStaygold-MfnG，获得具有野生型地上部和转基因/非转基因根混合的复合植株；将复合植株与表达OMY依赖NanoLuc的PY79共培养4–5天，发光局限于表达荧光标记的转基因根，表明OMY生物合成和细菌控制可推广至农业相关作物物种。
讨论总结与结论翻译：讨论指出，本研究将ncAA OMY确立为植物导向控制微生物活性的工具，通过植物OMY生物合成与细菌GCE结合使植物指导细菌基因表达；系统具有高特异性，共培养中工程菌发光集中于与野生型邻株并排生长的转基因植株周围；OMY具有轻度植物毒性，但其机制不同于已知化感ncAAs，条件性OMY生物合成可改善适合度成本并维持细菌控制。未来工作可探索OMY毒性机制，包括竞争性抑制芳香族氨基酸转运蛋白和生物合成酶、干扰生长素生物合成或信号（与根向重力性受损一致）以及干扰赤霉素生物合成或信号（与萌发降低一致），并探索缓解方法；未来还可针对农业土壤优化系统，提高氨酰-tRNA合成酶/tRNA对在低ncAA浓度下的翻译效率，工程化田间分离株，并针对不同菌株优化琥珀密码子配置；需在非灭菌土壤和多样原生微生物群落中测试脱靶效应及信号特异性。讨论还指出，OMY总体测量未反映共培养中根际报告基因激活水平，可能因总体测量低估根表OMY浓度，且非依赖报告基因在各基因型根附近小幅升高提示细菌密度可能在根附近增加；未来可通过组成型荧光标记、定量OMY和测定不同位置细菌CFU评估化学与细胞浓度梯度贡献。讨论强调，本研究将GCE从胞内蛋白工程扩展到生物间可编程互作，建立植物与环境相关微生物以ncAA为共享信号的跨界概念验证；ncAA植物导向控制微生物活性未来可用于调控其他促生蛋白、抗病原化合物生物合成酶、金属螯合剂和矿物溶解酶，组织特异和诱导型MfnG表达可扩展至响应植物胁迫、营养状态或发育线索的系统，并可在根际生物合成含非天然化学的蛋白质；该概念可扩展至其他ncAAs，并可能通过互正交tRNA/合成酶对实现多重信号。研究结论翻译：总之，本工作证明ncAAs可用于编程植物–微生物互作，并为基于工程化微生物伙伴关系的精准农业应用奠定基础。