人源Argonaute 2重编程实现靶向RNA的C-to-U碱基编辑：ALTER平台的构建、优化与去免疫化

《Nature Biotechnology》：Engineered human Argonaute 2 for targeted C-to-U RNA base editing

　　

依赖非人源蛋白的RNA操控工具，如基于IS-C（insertion-sequence-associated CRISPR，IS-C）和Cas的支架，可能对人细胞产生未知且未被充分理解的不良影响，并为治疗转化带来挑战。用经过工程化改造以获得扩展型可编程功能的人源蛋白替代上述非人源蛋白，可规避这些外源蛋白的限制。研究人员证明，人源Argonaute 2（AGO2）可被重编程为一种模块化RNA靶向结构域。将AGO2与C-to-U脱氨酶融合，可实现AGO引导的RNA靶向编辑（AGO-led targeted editing of RNA，ALTER）。利用能够重塑靶RNA结构以实现选择性编辑并降低核酸酶活性的引导RNA（guide RNA，gRNA），研究人员显示，在HEK293T细胞中，ALTER对mRNA靶点的C-to-U编辑水平平均比Cas13编辑器CURE和RESCUE高1.9倍。转录组水平RNA-seq显示，其与同类Cas13基编辑器相比具有相似或更低的脱靶编辑水平。机器学习模型预测，ALTER产生的免疫原性肽段更少，并且研究人员证明ALTER可适配经过验证的AI导向去免疫化工作流程。

研究背景方面，当前可编程RNA操控主要依赖CRISPR–Cas13等原核来源系统以及更广义的OMEGA家族蛋白。这类外源蛋白存在脱靶活性、与宿主调控机器未知互作、蛋白尺寸大、免疫原性和递送困难等问题；由于RNA会周转，RNA靶向治疗还可能需重复给药，从而放大免疫与稳态风险。内源哺乳动物RNA干扰（RNA interference，RNAi）机器中的人源Argonaute 2（AGO2）本身已具备小RNA编程、高效靶RNA结合、穿越二级结构和进化优化等性质，因此研究人员提出：重编程人源AGO2以获得dCas样非降解结合功能，可能比从头搭建或引入非人源支架更适合治疗场景。研究人员据此开展的研究是：将人源AGO2与APOBEC3A（A3A）脱氨酶融合，设计环诱导型gRNA使靶C处于单链环中，从而让A3A完成C-to-U编辑，并将该系统命名为ALTER（AGO-led targeted editing of RNA）。

论文发表在《Nature Biotechnology》。该研究的重要意义在于：首次把内源人源AGO2转化为模块化、可编程、低免疫原潜力的RNA碱基编辑平台，为替代Cas来源RNA编辑器提供了人源化路线。

主要关键技术方法方面，研究人员使用稳定整合EGFP^Y66H报告系统的HEK293T细胞评估环诱导gRNA参数；用AlphaFold3建模AGO2–A3A–gRNA–靶RNA三元复合物；通过已知功能位点突变和PAZ结构域截短对AGO2与A3A进行理性蛋白工程；在野生型HEK293T细胞中以PPIB、SMARCA4、ACTB、TYMS、MALAT1等内源转录本验证编辑范围；用mRNA-seq做转录组范围脱靶与差异表达分析；用MARIA深度学习模型预测主要组织相容性复合体II类（major histocompatibility complex class II，MHC II）呈递肽以指导去免疫化；并用病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）相关思路评估递送。

研究结果部分，第一节“Loop-inducing gRNAs enable RNA editing by AGO2–APOBEC3A (A3A) fusions”中，研究人员依据siRNA功能分区设计中心错配gRNA，使AGO2高亲和结合但不切割靶RNA，并在靶位形成单链环。结果显示，14L8(11,10)等环诱导gRNA可让AGO2–A3A^Y132D（ALTER-1）恢复EGFP^Y66H荧光，非靶向、缺gRNA、缺AGO2或A3A时均无此效；环大小、靶C在环中的位置及环相对gRNA的位置均影响编辑，证明环诱导结合模式能制造A3A有利底物且基本不引起靶转录本敲低。

第二节“ALTER activity can be improved by rational protein engineering”中，研究人员测试AGO异构体、核酸酶失活突变、MID结构域双突变F470V;F505V、ΔPAZ截短、Q633R及A3A突变。结果显示，AGO2^ΔPAZ;Q633R提升编辑并降背景，F470V;F505V降低P-body相关背景，A3A^K30R;Y132D增编辑但背景升高；组合后得到ALTER-2至ALTER-4，其中ALTER-4为AGO2^{F470V;F505V;Q633R}–A3A^K30R;Y132G，活性高且背景低；将A1脱氨结构域移植入A3A得到ALTER-5，可编辑GC/AC背景，说明效应域可替换。

第三节“ALTER is a highly active editor of endogenous RNA targets”中，研究人员将ALTER与CURE、RESCUE在EGFP^Y66H及内源基因比较。结果显示，ALTER-4在PPIB C90、ACTB C309、TYMS C876上显著高于Cas13编辑器，在SMARCA4 C503上与RESCUE相当；加核定位序列的ALTER-4N可编辑核内MALAT1；ALTER-5对PPIB C92（GC）编辑显著优于RESCUE-S；guide设计可同时优化主动编辑与旁编辑（bystander editing）。

第四节“Assessment of transcriptome-wide off-target activity”中，研究人员用mRNA-seq量化脱靶。结果显示，PPIB靶向ALTER-4仅有518个高置信脱靶编辑，低于RESCUE/CURE；TYMS导向脱靶较多但降低质粒剂量可在同等靶编辑下使脱靶降约25倍；脱靶序列呈现CCAUCG一致序列与茎环结构，主要源于A3A旁活性而非内源miRNA错位装载；ALTER未系统性扰乱miRNA调控组。

第五节“Machine-learning-assisted deimmunization of ALTER”中，研究人员用MARIA预测MHC II呈递肽。结果显示，Cas13编辑器预测呈递肽远多于ALTER；连接肽与蛋白交界肽是ALTER免疫原主要来源，定点突变得到ALTER-4M后可降预测免疫原性且保编辑活性；VLPs可包装ALTER RNP，提示人源平台具递送兼容潜力。

讨论与结论方面，研究人员总结：人源AGO2可被工程化为非降解、gRNA编程的RNA编辑支架；ALTER相较Cas13基C-to-U编辑器，在多个内源mRNA上更高或相当活性、脱靶更低或可比、预测免疫原肽更少；理性蛋白工程与AI去免疫化可进一步提升治疗适用性；A3A旁活性是主要脱靶来源，剂量与gRNA设计可优化安全边际；ALTER代表一种以人源进化优化蛋白替代非人源CRISPR效应器的RNA治疗思路。

研究结论可译为：人源Argonaute 2可被重编程为模块化RNA靶向结构域；AGO-led targeted editing of RNA（ALTER）利用环诱导gRNA实现选择性C-to-U编辑，在HEK293T细胞中平均编辑水平较CURE和RESCUE高1.9倍；转录组分析显示脱靶不高于Cas13系统；机器学习预测其免疫原肽更少且可经AI工作流去免疫化；该工作为低免疫原、人源化、可编程RNA碱基编辑提供了原理验证与工程框架。