《Microbial Pathogenesis》：Preparation of steam explosion modified pea protein peptides and its antibacterial mechanism against
Staphylococcus aureus
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•蒸汽爆破提高豌豆蛋白活性肽的产率。•采用单因素法和Box-Behnken设计优化了SE-PPP的制备工艺。•HPLC-MS/MS分析显示，SE-PPP中99.67%的分子量低于3 kDa。•SE-PPP对金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出显著的抗菌活性。•SE-PP
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蒸汽爆破提高豌豆蛋白活性肽的产率。
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采用单因素法和Box-Behnken设计优化了SE-PPP的制备工艺。
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HPLC-MS/MS分析显示，SE-PPP中99.67%的分子量低于3 kDa。
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SE-PPP对金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出显著的抗菌活性。
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SE-PPP破坏S. aureus的细胞壁和细胞膜，并损害其代谢功能。
引言
食品安全是一个重要的全球公共卫生问题，每年约有42万人因食用含有致病细菌的污染食品而死亡[1]，[2]。在各种污染物中，细菌污染是食品安全问题的主要因素之一，它不仅会降低食品质量，还可能对公众健康构成潜在威胁[3]，[4]。金黄色葡萄球菌（S. aureus）是肠毒素的主要产生菌之一[5]，在中国超过25%的食源性疾病与其相关[6]。目前，苯甲酸钠和山梨酸钾等化学防腐剂被广泛用于防止微生物污染[7]。然而，长期使用化学防腐剂可能会导致器官损伤和抗生素耐药性的产生[8]，这凸显了寻找具有强效抗菌活性和安全特性的天然替代品的必要性。
抗菌肽（AMPs）是来源于天然产物的生物活性分子[9]。近期研究发现，来源于斑角蟾（Odorrana grahami）的肽[10]、白点刺蛙（Heleioporus albopunctatus）[11]以及芝麻素衍生物肽[12]均表现出优异的抗菌活性。因此，AMPs凭借其广谱抗菌活性和较低的耐药性产生倾向，已成为传统抗菌剂的一种极具吸引力的替代品。植物来源的AMPs可作为食品保存中更为有效和稳定的替代选择[13]。豌豆肽（PP）是从豌豆中提取的生物活性成分[14]。PP具有丰富的氨基酸组成和生物活性序列，通过适当的酶解或物理改性可生产各种AMPs。Mohan等人[15]通过酶解制备了PP，并探索了其作为新型生物防腐剂的潜力。此外，来源于豌豆的NuriPep 1653对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）表现出强烈的抗菌活性[16]。PP通过破坏细胞膜和抑制DNA复制来发挥抗菌作用，从而引发细胞失活[9]。因此，PP因其强大的抗菌活性已成为AMPs研究中的热门话题。
近期研究报告了多种提高生物活性肽提取效率的方法，包括化学法、酶解法、发酵法和物理法[17]。蒸汽爆破（SE）作为一种绿色高效的物理改性技术，已被广泛应用于生物材料的预处理和功能成分的提取，可显著提高功能成分的提取效率并增强生物活性[18]。Dong等[19]发现，SE可提高罗非鱼皮水解物的最大水解度（DH）和肽含量，并促进其血管紧张素转化酶抑制活性。然而，目前尚无关于蒸汽爆破改性豌豆蛋白肽（SE-PPP）对S. aureus抑制机制的研究，关于SE在PP中应用的相关报道也较少。SE可诱导蛋白质构象变化，包括部分变性、氢键和疏水作用的破坏以及埋藏疏水基团和蛋白酶敏感位点的暴露。这些结构变化可提高后续酶解的效率，并促进更多潜在抗菌肽的生成。基于上述考虑，本研究采用SE预处理辅助酶解来生产豌豆蛋白生物活性肽。
因此，本研究旨在通过SE辅助酶解、单因素实验和Box-Behnken实验设计（BBD）优化高水解度SE-PPP的制备工艺，评价其对S. aureus的抗菌活性，并探究其抗菌机制，从而为开发天然抗菌剂提供新策略，并推动SE技术在功能蛋白改性中的应用。
章节摘要
试剂和材料
PP由烟台东方蛋白技术有限公司（中国山东烟台）提供。邻苯二甲醛（OPA）购自麦克林生物技术有限公司（中国上海）。碱性蛋白酶（1:200,000）、十二烷基硫酸钠（SDS）和二硫苏糖醇（DTT）均购自索莱宝科技有限公司（中国北京）。S. aureus ATCC 25923菌株由河南农业大学（中国河南郑州）提供。Luria-Bertani（LB）肉汤和营养
单因素实验分析
酶水解可断裂肽键，将蛋白质转化为不同分子量的氨基酸和多肽。DH表示蛋白质水解过程中断裂的肽键数与蛋白质总肽键数之比，是酶解效率的重要指标。豌豆蛋白肽的DH越高，表明游离氨基酸和低分子量肽的浓度越高[35]，[36]。每种蛋白酶都有其特异性的作用条件
结论
本研究在以下参数条件下获得了SE-PPP：底物浓度7.38%（w/v）、料液比（E/S）5%（w/w）、pH 9.5、55 °C水浴孵3 h。此外，SE-PPP对S. aureus表现出显著的抗菌活性，主要通过诱导胞内ROS生成，引发氧化应激。此过程导致细菌膜脂质过氧化，造成细胞壁和细胞膜结构损伤，并使
CRediT作者贡献声明
宋连军：撰写——审阅与编辑、监督、方法论、调查研究、正式分析、概念化。沈跃：方法论、正式分析。李宁：验证、正式分析。张延庆：撰写——初稿、方法论、调查研究、正式分析。乔明武：调查研究、正式分析。贺军晓：调查研究、数据整理。李前：撰写——审阅与编辑、方法论、资金获取、正式分析、概念化。黄显清：
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益关系或个人关系可能影响本文所报告的工作。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益关系或个人关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究受河南省高等学校重点科研项目资助（项目编号：25A550008）。
张延庆|乔明武|沈跃|李宁|黄显清|雷凤梅|贺军晓|李前|宋连军
