《Molecular and Cellular Neuroscience》：Loss of CRMP4 in astrocytes causes reduced scar formation and functional recovery of motor function after spinal cord injury
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•CRMP4 在脊髓损伤后调节反应性星形胶质细胞动力学和瘢痕结构。•星形胶质细胞特异性 CRMP4 缺失改善了小鼠的运动功能恢复。•Crmp4 在损伤后的增殖性星形胶质细胞亚群中上调。•CRMP4 可能代表一个调节瘢痕形成的治疗靶点。引言中枢神经系统 (CNS) 的物理损伤会
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CRMP4 在脊髓损伤后调节反应性星形胶质细胞动力学和瘢痕结构。
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星形胶质细胞特异性 CRMP4 缺失改善了小鼠的运动功能恢复。
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Crmp4 在损伤后的增殖性星形胶质细胞亚群中上调。
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CRMP4 可能代表一个调节瘢痕形成的治疗靶点。
引言
中枢神经系统 (CNS) 的物理损伤会导致神经元大量丢失，以及周围胶质细胞和血管细胞的损失。在中枢神经系统疾病中，脊髓损伤 (SCI) 尤为严重，导致进行性且很大程度上不可逆的组织损伤以及严重的运动、感觉和自主神经功能障碍 (Clifford et al., 2023)。SCI 后的恢复受到多种因素限制，其中轴突生长抑制剂和瘢痕形成被认为是轴突再生和功能恢复的主要障碍 (Sofroniew, 2018; Yiu and He, 2006)。机械创伤诱导神经元死亡和髓鞘碎片化，释放髓鞘相关抑制因子 (MAIs)，包括 Nogo-A (Caroni and Schwab, n.d.)、MAG (Liu et al., 2002) 和 OMgp (Kottis et al., 2002)，这些因子会抑制轴突再生。此外，由激活的星形胶质细胞和其他瘢痕相关细胞产生的细胞外基质 (ECM) 分子，如 CSPGs (Galtrey and Fawcett, 2007) 和 RGM (Monnier et al., 2002)，形成抑制性屏障，进一步限制轴突生长。
星形胶质细胞是中枢神经系统中占主导地位的胶质细胞，在胶质瘢痕形成中发挥关键作用。反应性小胶质细胞通过分泌 IL-1α/β、TNF-α和 C1q 等分子引发星形胶质细胞反应 (Fan and Huo, 2021)。激活的星形胶质细胞形成围绕病灶核心的边界，并调节免疫细胞浸润。此外，反应性星形胶质细胞产生包括 CSPGs 在内的 ECM 分子，有助于瘢痕稳定 (Clifford et al., 2023)。反应性星形胶质细胞 (RAs)，特别是增殖性星形胶质细胞，围绕病灶核心，一直被认为是 SCI 后轴突再生的主要障碍，因为它们既充当物理屏障又充当分子屏障 (Burda and Sofroniew, 2014; Sofroniew, 2020)。然而，最近的研究表明，反应性星形胶质细胞也可以通过表达层粘连蛋白和神经营养因子，以及提供支持损伤组织内轴突生长的结构支架来促进神经再生 (Anderson et al., 2016)。反应性星形胶质细胞看似矛盾的作用可能源于不同星形胶质细胞亚群的存在以及损伤微环境诱导的动态状态转变。因此，表征 SCI 后单个星形胶质细胞亚型的具体动力学和功能，预计将为理解胶质瘢痕形成和神经修复的机制提供重要见解。
为了更好地理解瘢痕环境中的星形胶质细胞异质性，Aldh1l1 已被确定为一种泛星形胶质细胞标志物。与传统标志物 GFAP 相比，它被认为在星形胶质细胞中表达更广泛 (Cahoy et al., 2008)。因此，我们采用基于 Aldh1l1 的遗传方法，全面检查 SCI 后胶质瘢痕形成期间星形胶质细胞特异性功能。
瘢痕形成涉及广泛的细胞迁移、增殖和形态重塑——这些过程从根本上由细胞骨架动力学控制 (Chambel and Cruz, 2023; Hellal et al., 2011)。因此，调节细胞骨架信号可能代表一种有前景的策略，可以同时减轻轴突生长抑制、炎症和瘢痕形成。崩溃反应介导蛋白 4 (CRMP4)，CRMP 家族的一员，在 SCI 后上调，最近作为一种有可能促进瘢痕减少和轴突再生的分子脱颖而出 (Nagai et al., 2015)。要了解 CRMP4 如何发挥这些双重作用，必须考虑其在细胞骨架动力学中的作用。作为一种受磷酸化调节的微管相关蛋白，CRMP4 调节细胞迁移和轴突延伸。Semaphorin3A (Sema3A) 诱导的 CRMP4 磷酸化会降低其对微管蛋白异二聚体和 F-肌动蛋白的亲和力，导致生长锥内细胞骨架不稳定 (Yamashita and Goshima, 2012; Alabed et al., 2010; Khazaei et al., 2014)。同时，CRMP4b 长亚型以磷酸化依赖的方式与小 GTPase RhoA 相互作用，并作为抑制性信号传导的关键介质 (Alabed et al., 2007)。通过这些机制，CRMP4 促进微管和肌动蛋白解聚，最终导致生长锥塌陷和轴突再生受损。除了其神经元功能外，CRMP4 表达在 SCI 后的小胶质细胞和星形胶质细胞中上调——这些细胞类型在瘢痕形成中发挥核心作用。值得注意的是，CRMP4 的全局缺失显著减轻了损伤后的瘢痕形成 (Nagai et al., 2015)。尽管有这些发现，CRMP4 调节瘢痕形成的分子机制，特别是在星形胶质细胞中，仍很大程度上尚不清楚。
在本研究中，我们鉴定出星形胶质细胞中的 CRMP4 是一种与增殖和激活相关的分子，在增殖性星形胶质细胞中尤为富集。在 Aldh1l1 阳性星形胶质细胞中条件性敲除 Crmp4 减少了胶质瘢痕形成，减轻了星形胶质细胞和小胶质细胞的反应性，并显著改善了 SCI 后的功能恢复。此外，野生型小鼠半横断脊髓的单细胞转录组分析显示，Crmp4 在位于瘢痕边缘的一个高度增殖的、祖细胞样的星形胶质细胞亚群中优先表达。总之，我们的发现表明 CRMP4 有助于调节增殖性星形胶质细胞，将细胞骨架调节与 SCI 后的瘢痕形成和再生失败联系起来。
章节片段
动物与小鼠饲养
小鼠饲养在 12 小时光暗周期下，自由摄取食物和水。所有小鼠的饲养和处理均按照经早稻田大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的方案进行。使用 10-12 周龄的雌鼠进行 SCI 实验，以比较瘢痕面积和巴索小鼠量表 (Basso Mouse Scale) 测量值，因为雌鼠通常在 SCI 后比雄鼠表现出更好的预后。为了确认 Aldh1l1 Crmp4 cKO 小鼠中的 CRMP4 条件性敲除 (cKO)
Aldh1l1 Crmp4 cKO 小鼠中 CRMP4 的减少
使用 Cre–LoxP 系统在星形胶质细胞中条件性敲除 Crmp4。为了验证 Aldh1l1 Crmp4 cKO 小鼠中星形胶质细胞特异性 CRMP4 的缺失，我们使用针对 CRMP4 和星形胶质细胞标志物 GFAP 的抗体进行了免疫组化。在损伤部位尾侧 3 毫米处，与 Crmp4flox/flox 对照小鼠相比，Aldh1l1 Crmp4 cKO 小鼠表现出 CRMP4 与 GFAP 阳性星形胶质细胞共定位的显著减少 (图 1a)。定量分析证实 CRMP4 显著减少
讨论
在本研究中，使用 Aldh1l1 Crmp4 cKO 小鼠，我们证明星形胶质细胞的 CRMP4 调节增殖性星形胶质细胞反应，调节胶质细胞激活和瘢痕形成，并有助于 SCI 后的功能恢复。由于我们在 SCI 后观察到 CRMP4KO 和 Aldh1l1 CRMP4 cKO 小鼠在瘢痕形成减少和运动恢复方面的表型相似性，我们的结果表明 CRMP4 的星形胶质细胞内在功能负责全局 CRMP4 敲除的表型
结论
总之，本研究证明 CRMP4 可能在星形胶质细胞增殖和激活中发挥至关重要的作用，且在星形胶质细胞中缺失时与运动功能恢复改善相关。这些发现确定 CRMP4 为 SCI 的一个有前景的治疗靶点，并支持选择性调节星形胶质细胞瘢痕形成的策略。
CRediT 作者贡献声明
Leo Shimizu： 撰写 – 初稿，调查，数据整理。Ryo Asahina： 调查。Toshio Ohshima： 撰写 – 审阅与编辑，资金获取，概念化。
伦理批准
所使用的小鼠符合早稻田大学机构动物护理和使用委员会批准的方案。所有动物实验均基于 ARRIVE 指南进行。
写作过程中生成式人工智能和人工智能辅助技术的声明
在准备本手稿过程中未使用任何生成式人工智能工具。所有内容，包括分析和写作，均由作者独立完成。
资金来源
日本科学技术振兴机构 (JSPS) 科学研究费辅助金 (25K09840 至 T.O)。
利益冲突声明
作者声明，与本论文的发表不存在利益冲突。
致谢
本工作由日本科学技术振兴机构 (JSPS) 科学研究费辅助金 (25K09840 至 T.O) 支持。
Leo Shimizu|Ryo Asahina|Toshio Ohshima
