心理社会应激下猪唾液、血液及腹内侧下丘脑长链非编码RNA Neat1和Neat12表达的检测可行性研究

《Physiological Reports》：Expression of the long noncoding RNA Neat1 in saliva, blood, and ventromedial hypothalamus of pigs exposed to psychosocial stressors

长链非编码RNA核旁斑组装转录本1（NEAT1）是应激反应中转录和转录后变化的主要调控因子。研究人员采用定量PCR（qPCR）评估了12周龄猪在慢性（社会混群导致冲突）和急性（束缚）心理社会挑战下外周生物体液（唾液和血液）以及调节应激和情绪的脑区（腹内侧下丘脑）中Neat1 lncRNA的表达。研究人员证明Neat1可在猪唾液、血液和脑样本中检测到。在三种组织类型中成功测量Neat1 lncRNA进一步证实了NEAT1基因广泛的组织表达以及跨物种保守序列。研究人员发现Neat1₂和Neat1总表达在组织间不相关，提示全身表达可变，并且两种应激源均未引起Neat1 lncRNA水平的显著差异。研究人员还观察到，在所有处理组中，比较干预前与干预后样本，Neat1₂和皮质醇水平发生变化，表明混杂因素可能影响了模型。总体而言，本研究证明从农场哺乳动物获得的生物体液中测量Neat1的可行性，需要进一步工作评估Neat1 lncRNA作为参与心理社会应激生理反应的分子。

长链非编码RNA（lncRNA）核旁斑组装转录本1（NEAT1）是哺乳动物中参与应激、应激恢复和疾病相关生物过程的分子。现有NEAT1研究多集中于强应激刺激的细胞或动物模型以及癌症、脓毒症等疾病，针对心理社会应激的研究主要见于Neat1敲除小鼠行为学证据，尚缺乏大型动物模型中的对应研究。NEAT1基因产生短型NEAT1₁和长型NEAT1₂，后者是旁斑形成的支架，且NEAT1可在血液、唾液等易获取生物体液中检测。基于农场哺乳动物福利状态生物标志物需求，研究人员以猪（sus scrofa）为对象，检验心理社会应激和正强化条件下Neat1在血液、唾液及腹内侧下丘脑（VMH）中的表达变化，假设两种心理社会挑战后Neat1总表达和Neat1₂表达在外周体液和脑区升高。研究使用36头12周龄猪（18雄18雌），来源于CHM Westbrook Research facility的144头队列；猪接受4周中性、正强化或负性混群环境处理，半数组再接受5 min鼻套束缚急性应激，采集血液、唾液和VMH，并以血浆皮质醇作为应激指标。研究结论为Neat1可在猪唾液、血液和脑样本中检测，支持其广泛组织表达和跨物种保守性；但两种处理均未引起Neat1显著差异，组织间Neat1表达不相关，且两次采样间Neat1₂和皮质醇变化提示混杂因素可能影响模型。该研究意义在于首次展示在农场哺乳动物非侵入性体液中测量Neat1的可行性，并为后续评估其作为心理社会应激生理反应相关分子奠定基础。关键技术方法概括：研究人员使用来自144头猪队列的36头12周龄猪，按中性、正强化、负性混群处理4周，半数行5 min鼻套束缚；采集血液、唾液及VMH，提取总RNA并经逆转录后以实时qPCR检测Neat1总与Neat1₂表达，以geNorm、NormFinder、比较ΔCt和BestKeeper结合RefFinder筛选稳定内参，采用Rpl4、Gapdh、Ppia组合并以Pfaffl法计算相对表达；血浆皮质醇用I¹²⁵放射免疫分析（RIA）测定；统计采用混合模型、ANOVA/Kruskal-Wallis、Pearson相关和简单线性回归。

研究结果：3.1 The effect of long-term experiential conditions on average daily weight gain（长期经历条件对平均日增重（ADG）的影响）：对36头生物采样猪计算4周ADG，未发现环境处理或性别对ADG的影响（p=0.10；p=0.40）。3.2 The effect of stress challenges on Neat1 expression at end time point sampling in the ventromedial hypothalamus and saliva（终点采样时应激挑战对VMH和唾液Neat1表达的影响）：VMH和唾液RNA提取产量不同；RT-qPCR显示VMH中Neat1总、Neat1₂及Neat1₂百分比均未受环境或急性处理影响（Neat1总p=0.171、p=0.272；Neat1₂ p=0.293、p=0.517；百分比p=0.995、p=0.762）。唾液Neat1总未受环境处理影响（p=0.15），但急性束缚组显著低于无束缚组（p=0.01）；唾液Neat1₂及百分比未受环境或急性处理影响（Neat1₂ p=0.90、p=0.54；百分比p=0.73、p=0.53）。3.3 The effect of challenges in pig blood on Neat1 expression and plasma cortisol at two time points（两个时间点猪血液中挑战对Neat1表达和血浆皮质醇的影响）：血液Neat1总变化未受环境或急性处理影响（p=0.42；p=0.06）；Neat1₂未受处理影响，但存在时间效应（p=0.023），第一次采样高于终点；Neat1₂百分比时间趋势p=0.07；时间×性别交互（p=0.025），基线雌性高于雄性，第二次雌雄均下降。皮质醇存在时间×环境交互（p=0.038），终点所有组高于基线；时间×性别交互（p=0.046），雌性基线高于雄性，终点均升高；急性应激无影响。3.4 Correlations of Neat1 expression in blood, saliva and ventromedial hypothalamus at end time point sampling（终点采样血液、唾液和VMH中Neat1表达的相关性）：对同一个体终点样本行Pearson相关和简单线性回归，VMH与血液、唾液与VMH、唾液与血液的Neat1总、Neat1₂及百分比均无显著相关。3.5 Correlations of Neat1 expression in blood, saliva and ventromedial hypothalamus with plasma cortisol at end time point sampling（终点采样Neat1表达与血浆皮质醇的相关性）：各组织Neat1总、Neat1₂及百分比与血浆皮质醇均无显著相关。

讨论总结：原文讨论指出，本研究首次在猪血液、唾液和VMH中测量Neat1；由于猪ss_Neat1未注释，研究人员基于人NEAT1与猪基因组比对设计引物并获得扩增子，近期注释结果也确认了所识别区域。原文认为血液Neat1可能主要来源于外周血单核细胞（PBMCs），VMH中Neat1在胶质细胞表达较高。组织间不相关提示组织特异性应激通路；处理未影响Neat1与应激背景/强度、采样时点和未重复采样有关；终点采样时所有猪皮质醇升高提示操作和屠宰相关应激可能掩盖处理效应；Neat1₂两次采样下降与时间/年龄或采样混杂有关，原文明确年龄不能排除。原文建议未来设置更强、更明确的正负环境对比，单独研究急性或慢性应激，增加采样频次和采样时点，并检测其他脑区和物种。研究结论（翻译）：尽管存在局限，本研究显示Neat1表达水平受两次独立猪经历影响，并可在两个采样时间点的血液中检测到；但未重复采样和应激源背景有限，不能得出Neat1₂变化是心理社会应激反应真正生物标志物的结论。本研究为探索性研究，旨在证明Neat1 lncRNA可在猪血液和唾液中测量，且NEAT1表达对某种情绪体验具有一定敏感性。因此，应使用不同应激事件进一步检验Neat1表达在猪中的相关性，并研究前额叶皮质等其他情绪相关脑区及在其他家养或非家养物种中的表达。