《Materials Today Bio》：Novel modifications of small extracellular vesicles to enhance cardiac-specific delivery of siPKA RNA and edaravone against ischemia-reperfusion cardiac injury
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亮点：KOdiA-PC/IMT双功能小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs；KI-sEVs）在缺血心肌中的靶向性提高10倍；CD36靶向修饰可显著改善sEVs跨心脏内皮细胞的转运；KI-sEVs能够高效递送PKA C
亮点：KOdiA-PC/IMT双功能小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs；KI-sEVs）在缺血心肌中的靶向性提高10倍；CD36靶向修饰可显著改善sEVs跨心脏内皮细胞的转运；KI-sEVs能够高效递送PKA Cα小干扰RNA（siPKA Cα）与依达拉奉（edaravone, EDV）用于缺血/再灌注心脏治疗；靶向过度激活的蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）和活性氧（reactive oxygen species, ROS）的siPKA RNA与EDV表现出显著协同效应。研究人员设计了一种多级靶向药物递送系统，通过KOdiA-PC（一种CD36配体）与缺血心肌靶向肽（ischemic myocardium-targeting peptide, IMT）双修饰sEVs，分别赋予其心脏内皮细胞和心肌细胞靶向能力；同时将siPKA Cα和EDV载入sEVs，以分别沉默PKA Cα表达和清除ROS。再灌注开始时，载药sEVs可及时蓄积于损伤区清除过量ROS；随后siPKA Cα抑制PKA持续激活，实现对心脏损伤的长期保护。结果表明，该系统显著提高跨内皮转运效率，并在心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI）后有效保护心肌细胞。所提出的多级靶向sEVs药物递送系统为MIRI提供了创新的靶向递送策略和协同治疗方案。
该研究由Xing Pei、Rui Li、Yingyu Bai等完成，发表于《Materials Today Bio》。心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI）可占最终心肌梗死面积最高50%，是恢复血流获益的严重障碍；其病理涉及钙超载、氧化应激、线粒体通透性转换孔开放、细胞死亡和过度炎症。单一药物、稳定性低、靶向性低及全身给药后心脏蓄积低限制临床疗效。小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）低免疫原性、生物相容性好并能保护货物，但心脏靶向和原位递送不足，心脏紧密内皮及再灌注后内皮间隙关闭使纳米颗粒跨内皮转运受限。鉴于心脏微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells, CMEC）高表达CD36且脂肪酸跨内皮转运依赖CD36，研究人员提出KOdiA-PC（一种CD36配体）和缺血心肌靶向肽（ischemic myocardium-targeting peptide, IMT）双修饰sEVs，并共载PKA Cα小干扰RNA（siPKA Cα）与依达拉奉（edaravone, EDV），分别抑制蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）过度激活和清除活性氧（reactive oxygen species, ROS）。结论是KI-sEVs增强跨内皮转运和心肌靶向，协同保护MIRI和心肌梗死（myocardial infarction, MI）。意义在于为缺血性心脏病提供新型靶向递送与协同治疗策略。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员从HEK293T细胞培养上清超速离心分离sEVs，用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析表征，Western blot检测CD9、CD63、TSG101；KOdiA-PC经脂链插入、IMT经无铜点击化学偶联制备K-/I-/KI-sEVs，并以流式及荧光评价修饰。分离C57BL/6小鼠CMEC，比较CMEC、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）和脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMEC）的CD36表达与摄取；建立氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD-R）的HL-1细胞模型和Transwell跨内皮转运模型。动物为C57BL/6J小鼠；CD36 fl/fl与Tie2-MerCreMer小鼠来自GemPharmatech，rAAV9. Myh6-Cre用于心肌细胞CD36缺失；构建MIRI和永久性心肌缺血（permanent myocardial ischemia, pMI）模型，行超声、Evans blue/TTC、H&E/Masson及血液生化评价。
Preparation and identification of dual-targeted modified sEVs：HEK293T来源sEVs呈杯状，平均直径124.9±6.5 nm，富集CD9、CD63、TSG101而β-actin低；双修饰后形貌典型，峰粒径约134 nm，流式显示93% sEVs同时带Cy5和BodiPY信号，说明双修饰成功。
Targeting ability of dual-targeted modified sEVs in vitro and in vivo：CMEC几乎均CD31阳性且摄取Ac-LDL；CD36在CMEC高于HUVEC和BMEC；K-sEVs在CMEC摄取显著高于BMEC/HUVEC，KOdiA-PC预处理降低其内化；OGD-R下I-sEVs和KI-sEVs在HL-1的荧光较sEVs增2.6倍和3.0倍。健康小鼠中K-sEVs和KI-sEVs心脏信号高于sEVs和I-sEVs，IMT不增强未损伤心肌蓄积；MIRI后即刻KI-sEVs心脏信号较K-/I-sEVs高约2.3倍，术后2周KI-sEVs仍高于I-sEVs；双EC/CM-CD36-/-小鼠中K-sEVs心脏蓄积显著减弱，其他器官无显著差异；MIRI小鼠静脉注射CM-DiI-sEVs后心肌细胞可见红色荧光，提示跨内皮并被心肌细胞摄取。
Preparation and characterization of sEVs loaded with siRNA and edaravone：载药sEVs峰粒径约136 nm，形貌典型；EDV和siRNA包封率分别为12.57±2.83%和91.66±0.27%；RNase A处理后游离siRNA 120 min几乎不可检测，而sEVs/siRNA约一半仍可见；sEVs/siRNA-Cy5在HL-1胞质显示CM-DiI和Cy5，裸siRNA-Cy5信号可忽略，说明sEVs促进siRNA内化。
Enhancing transendothelial transport effect of KOdiA-PC modified sEVs：Transwell中上室为CMEC时，K-sEVs组下室HL-1的Cy3平均荧光强度约为sEVs组4.7倍；上室为HUVEC时两组仅轻微荧光；KOdiA-PC预处理或CMEC中CD36敲低后，K-sEVs转运显著降低并与sEVs无显著差异；下室荧光随时间在K-sEVs组显著增加，sEVs组无显著变化，表明CD36–KOdiA-PC相互作用关键。
Therapeutic effects of siPKA and EDV loaded sEVs in vitro：两条siPKA Cα使HL-1中PKA Cα mRNA降约40%而不影响PKA Cβ，siPKA Cα #1沉默更佳；载入sEVs后显著降低OGD处理HL-1的PKA Cα mRNA和蛋白，蛋白较sEVs/siNC降约55%；EDV和sEVs/EDV显著降低H
2O
2诱导的ROS荧光；Live/Dead显示sEVs/EDV减少OGD死亡细胞，EDV/siPKA进一步降低，初步验证保护作用。
Targeted therapy with KI-sEVs/siPKA/EDV for MIRI in vivo：MIRI小鼠于day1、7、14静脉注射；24 h Evans blue/TTC显示缺血风险区（area at risk, AAR）各组相当，PBS梗死面积最大，KI-sEVs/siPKA/EDV降至12.01%；超声显示21天PBS组左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）34.51±12.18%、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）16.48±6.09%，KI-sEVs/siPKA/EDV恢复最佳且优于sEVs/siPKA/EDV和I-sEVs/siPKA/EDV；PBS收缩末期和舒张末期左心室内径（LVID;s/LVID;d）显著增大，其他组较轻；体内siPKA Cα#1降低post-MIRI心脏PKA Cα表达；H&E/Masson显示PBS左室游离壁厚度降低最明显、梗死大小35.89±5.16%，KI组仅5.91±4.52%，心肌细胞横截面积正常化，说明减梗死并改善心功能。
Targeted therapy of KI-sEVs/siPKA/EDV for permanent MI in vivo：pMI模型中42天KI-sEVs/siPKA/EDV心功能恢复最佳，B-mode Simpson LVEF 45.02±6.57%、M-mode LVEF 47.54±6.44%、LVFS 23.71±1.74%，显著优于PBS（LVEF 24.42±5.47% by B-mode、24.65±3.87% by M-mode、LVFS 11.99±1.55%）；PBS左心室内径显著扩大而其他组轻度；Masson梗死大小PBS 28.92±10.14%，KI组15.36±5.84%，提示pMI中亦有心肌保护。
Biosafety assessment：HL-1中sEVs、KI-sEVs、KI-sEVs/siNC/EDV在0–100 μg/mL 48 h不影响细胞活力，而Lipofectamine 2000组降至50.0%；体内21天血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）无明显变化，主要器官系数在正常范围，心脏指数较PBS降低，主要器官H&E无明显组织学改变，提示良好生物相容性。
讨论部分指出，纳米递送在肿瘤中受增强渗透和滞留（enhanced permeability and retention, EPR）效应促进蓄积，但缺血心肌血管通透性仅短暂增加并在再灌注后恢复，完整内皮屏障限制纳米颗粒进入；心脏毛细血管内皮CD36高表达，KOdiA-PC修饰增强内皮结合和跨内皮转运，IMT靶向损伤心肌。双修饰分别插入和共价偶联，操作简便，利于临床转化。MIRI和MI机制复杂，ROS过量及交感/β-肾上腺素能持续激活导致PKA过度激活是关键；siRNA存在脱靶、分子量大、难递送和易被核酸酶降解等问题，EDV静脉给药易被体内自由基中和，需大剂量频繁输注；sEVs共载可提高循环稳定性和局部有效浓度。HEK293T来源sEVs高产、无毒，但自身无明显心肌保护作用，未来可按治疗目的选择间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）来源sEVs；该策略可通过更换siRNA序列或小分子类型拓展至其他心脏病。
研究结论翻译：在本研究中，研究人员开发了一种新型双修饰多级sEVs药物递送系统，其增强了对损伤和完整心肌的心脏靶向，用于共递送EDV和siPKA Cα。该目标通过用KOdiA-PC修饰sEVs以增强心脏偏好的跨内皮转运实现。经该系统转运至心肌的EDV和siPKA Cα可有效保护心肌细胞并改善MIRI和MI的心功能。总之，研究人员设计了一种克服心脏转运差和药物蓄积低技术瓶颈的新型sEVs递送系统，可用于治疗缺血性心脏病。
