《Journal of Virological Methods》：Development of a rapid RPA-CRISPR/Cas12b assay for dual detection of Hantaan virus and Seoul virus
编辑推荐：
•开发了一种快速的RPA-CRISPR/Cas12b检测法，用于同时检测HTNV和SEOV。•专门设计的sgRNAs和RPA引物确保了零交叉反应。•检测限达到每小时每反应10个拷贝。•使用鼠类临床样本进行了可行性验证，准确率达100%。•该免仪器平台非常适合口岸卫生和现场PO
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开发了一种快速的RPA-CRISPR/Cas12b检测法，用于同时检测HTNV和SEOV。
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专门设计的sgRNAs和RPA引物确保了零交叉反应。
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检测限达到每小时每反应10个拷贝。
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使用鼠类临床样本进行了可行性验证，准确率达100%。
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该免仪器平台非常适合口岸卫生和现场POCT使用。
引言
正布尼亚病毒属于汉坦病毒科，是有包膜、分节段、单股负义RNA病毒，其基因组由大片段（L）、中等片段（M）和小片段（S）组成（Lee和Song，2019）。这些病毒主要在啮齿动物宿主中维持，可引发肾综合征出血热（HFRS）或汉坦病毒肺综合征（HPS）（Elliott，2013；Li等，2020）。全球每年约有20万人受汉坦病毒感染影响。HFRS的病死率高达12%，而美洲地区的HPS报告的病死率约为40%（Tian和Stenseth，2019）。中国是HFRS的全球疫情中心，占所有报告病例的90%以上，其中汉坦病毒（HTNV）和汉城病毒（SEOV）是已确定的主要流行血清型，影响肾功能（Huang等，2012）。
2014年至2023年，中国31个省/市报告了91,388例病例，平均发病率为每10万人0.65例（Zheng等，2025）。人类感染通常通过接触感染 rodents 或其排泄物而发生在半家栖环境中。鉴于目前尚无获批的暴露后治疗药物，开发稳健、高精度的监测和诊断技术仍然是公共卫生领域的优先事项（Hartman和Myler，2023；Sehgal等，2023；Shang等，2020）。
目前的标准诊断方法依赖血清学检测（如IgM/IgG检测）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）（Munir等，2021）。然而，血清学检测常受早期感染窗口期和交叉反应的阻碍，而RT-PCR——尽管分析灵敏度高——仍受限于较长的周转时间、高成本以及对专业实验室基础设施的需求（Zeng等，2022）。因此，迫切需要开发快速、灵敏且可在现场部署的分子诊断工具。
重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种等温核酸扩增技术，通常工作在39–42℃，具有快速动力学和高灵敏度，适合在资源有限的条件下进行即时检测（POCT）（Piepenburg等，2006）。同时，基于CRISPR/Cas的诊断技术通过可编程切割靶核酸彻底改变了分子鉴定领域。具体而言，Cas12b效应蛋白相比Cas12a具有更优的热稳定性。在单链向导RNA（sgRNA）的引导下，Cas12b识别特定的PAM序列（5′-TTN-3′）以执行精确的双链DNA切割，为分子生物传感提供了一条高度特异且简化的途径（Nguyen等，2022b；Teng等，2018）。
在本研究中，我们开发了一种两步法RPA-CRISPR/Cas12b系统，用于HTNV和SEOV的初步检测。通过优化病毒特异性RPA引物和sgRNAs，我们使用质粒稀释系列和阳性鼠类样本评估了其分析性能。该系统是开发高效便携HTNV和SEOV诊断工具的重要一步。它旨在作为初步的便携筛查工具，其有效性和可靠性需要使用更大、更多样的样本集进行进一步验证。
章节摘要
重组质粒的构建与合成
从HTNV（GenBank ID：HQ655988.1）和SEOV（GenBank ID：MF149952）中选定的保守基因组区域进行合成、连接并克隆至pUC-57载体骨架中（武汉天一华宇基因技术有限公司），以建立标准重组质粒对照。通过分光光度法定量的质粒制备为10倍梯度稀释系列，并储存于?80℃直至后续分析。
sgRNAs和RPA引物的设计与合成
每种病毒设计了3个候选sgRNAs，靶向不同的保守位点。该
sgRNAs和RPA引物的优化与筛选
测量了由靶向HTNV和SEOV靶标的三种sgRNAs扩增的CRISPR反应产物及其对应模板的荧光强度。sgRNA优化阶段的荧光曲线和数据分析结果见图1（A–D）。结果表明，HTNV靶标的HTNV-sgRNA-1（图1A）和SEOV靶标的SEOV-sgRNA-1（图1C）较早达到平台期。对荧光强度的统计分析
讨论
HTNV和SEOV是推动HFRS流行的主要病毒威胁，约90%的全球临床病例集中于中国（Chen等，2023；Wang等，2015）。流行病学模型表明，HTNV的传播主要由农村和林地生态系统中的黑线姬鼠（Apodemus agrarius）宿主维持，而SEOV则与城市中心的家栖褐家鼠（Rattus norvegicus）种群密切相关（He等，2026；Wang等，2024b）。临床上，HFRS表现为
伦理声明
本研究无需伦理委员会批准。所有实验用动物均采集自野外自然栖息地。本研究不涉及人类或脊椎动物受试者，也未对活体动物进行任何实验操作。因此，本研究无需伦理批准和知情同意。所有采集活动均符合当地法规，且未涉及濒危或受保护物种。
作者声明
所有对本手稿所述工作作出实质性贡献的人员。
CRediT作者贡献声明
郭若文：原稿撰写、正式分析、数据整理。唐海涛：审阅与编辑、方法论、数据整理。付洪坤：资源提供、数据整理。王蔚琳：验证、资源提供、调查研究。于宝生：项目管理。熊梦雅：原稿撰写、正式分析。徐佳：审阅与编辑、方法论。胡超杰：项目管理、概念构思。陈小雨：资源提供、调查研究、经费获取。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益关系或个人关系。
致谢
本研究由海关总署科研课题（2024HK235）和国家自然科学基金委员会（NO.82370594）资助。
郭若文|唐海涛|付洪坤|王蔚琳|于宝生|熊梦雅|徐佳|胡超杰|陈小雨
