早期谱系分离界定丘脑感觉相关与运动关联身份：时空单细胞多组学与谱系追踪揭示Sp9调控视觉丘脑命运

《Nature Neuroscience》：Early lineage divergence segregates sensory and motor-associative identities in the thalamus

　　

丘脑通过不同的核团整合感觉、运动和联合功能，但驱动其特化的发育原理仍不清楚。研究人员构建了胚胎小鼠丘脑的时空单细胞多组学（single-cell multiomics）和空间转录组学（spatial transcriptomics）图谱，并结合基于条形码的谱系追踪（lineage tracing）。研究人员鉴定出两个主要谷氨酸能（glutamatergic）谱系，即感觉相关谱系和运动关联（motor-associative）谱系，二者分别受不同的基因调控程序（gene regulatory programs）和时间动态控制。这些谱系起源于空间和分子上不同的祖细胞域（progenitor domains），揭示功能身份（functional identities）的早期分离。在感觉谱系内，研究人员解析了分支的感觉发育轨迹（sensory trajectories），其通向一级（first-order, FO）视觉和躯体感觉神经元，二者均从共享的高级感觉核样（higher-order-like, HO-like）状态产生。利用计算机模拟（in silico）预测和体内（in vivo）扰动，研究人员鉴定Sp9为视觉丘脑命运（visual thalamic fate）的关键调控因子。总之，研究结果定义了支撑丘脑模态特化（thalamic modality specification）的分子架构和发育轨迹，为理解哺乳动物大脑中功能环路如何形成提供了框架。

论文解读文章：丘脑通过解剖和功能不同的核团整合感觉、运动和联合功能，其兴奋性神经元起源于胚胎尾侧丘脑神经上皮祖细胞。既有研究已描述丘脑神经发生时间线、发育轨迹、渐进性命运限制以及核团间优先克隆关系，但指导不同丘脑谱系及其功能模态（modality）特化的分子与时间机制仍不清楚。为回答该问题，研究人员构建胚胎小鼠丘脑时空单细胞多组学（single-cell multiomics）与空间转录组学（spatial transcriptomics）图谱，并结合基于条形码的谱系追踪（lineage tracing），解析谷氨酸能（glutamatergic）丘脑发育。该研究发表于《Nature Neuroscience》。其结论是：感觉相关与运动关联丘脑身份由早期分离的谱系和不同基因调控网络（gene regulatory network, GRN）驱动；感觉谱系中一级（first-order, FO）视觉和躯体感觉核团来自共享祖池，并经历高级感觉核样（higher-order-like, HO-like）中间状态；Sp9是视觉丘脑身份的关键调控因子。重要意义在于建立丘脑模态特化的统一发育框架，并为联系发育程序、环路功能及功能障碍提供分子基础。

关键技术方法：样本为小鼠胚胎/出生后丘脑（C57BL/6J或ICR/CD-1；多胚胎合并为独立重复，TrackerSeq与CRISPRi分别合并3–4个和8个脑）。E11.5、E14.5、E16.5行第三脑室FlashTag（FT）短时脉冲标记，12 h后以荧光激活细胞分选（FACS）获取FT⁺细胞，行配对单核RNA测序（snRNA-seq）与单核ATAC测序（snATAC–seq）；E12、E17空间转录组学定位祖细胞域和谱系签名；E11.5经子宫内电穿孔（IUE）导入TrackerSeq条形码，P2取尾侧丘脑行snRNA-seq重建克隆关系；E11.5 IUE递送Sp9 CRISPR干扰（CRISPRi），P0行组织学、定量PCR（qPCR）及分选/显微切割背外侧膝状核（dLG）的snRNA-seq。

结果：（1）单细胞多组学解析丘脑神经元个体发生（Ontogeny of thalamic neurons revealed by single-cell multiomic profiling）。研究人员整合FT短时标记与snRNA-seq/snATAC–seq，获得25,477个高质量图谱；E11.5识别Prog1–Prog4，E12空间转录组显示部分分离的祖细胞域，Prog2（Tcf7l2）偏尾侧谷氨酸能、Prog3（Nkx2.2/Arx）偏前丘脑GABA能；限定表达Tcf7l2的谷氨酸能谱系后重建cTh.Progs→Int.Progs→Glut.Ns连续轨迹，并分为3个cTh.Progs亚类、2个Int.Progs亚类和8个Glut.Ns亚型；GO分析显示增殖、神经发生和突触传递/膜兴奋性功能分工。结论：尾侧丘脑祖细胞存在空间和转录组织，并沿连续轨迹产生离散谷氨酸能亚型。

（2）时间编码谱系分叉为感觉相关与运动关联丘脑命运（Time-encoded lineages diverge into sensory-related and motor-associative thalamic fates）。轨迹重建显示lineage 1（cTh.Progs1→Int.Progs1→Glut.Ns1–5）和lineage 2（cTh.Progs2→Int.Progs2→Glut.Ns6–8）；lineage 1富集感觉核程序Gbx2、Ntng1、Kirrel3、Rora、Robo2，lineage 2富集运动/联合程序Klhl1、Msi2、Kcnma1、Ebf1、Robo1；E17空间转录组显示lineage 1对应腹外侧感觉域，包括腹侧后内侧核（ventral posteromedial, VPM）、dLG、vMG、VPL及前核签名，lineage 2对应VA/VL/VM与MD/CM；Pando推断的GRN显示lineage 1涉及Hes1、Mef2a、Rora、Rorb，lineage 2涉及Onecut1/2、Nr2f2、Foxp2、Ebf1、Neurod1；CellOracle预测Hes1与Neurod1为谱系关键调控因子（transcription factor, TF）。结论：感觉相关与运动关联身份由空间/分子不同的早期谱系和不同GRN驱动。

（3）FO感觉核从HO默认状态出现（FO sensory nuclei emerge from an HO default state）。lineage 1轨迹分叉至dLG和VPM；E11.5 IUE TrackerSeq至P2，9,794个高质量细胞整合显示HO和FO沿分支分布，FO的dLG/VPM转录不同；FT队列评分显示E14.5主要富集HO样签名，FO样特征由2.1%升至17.6%（E14.5→E16.5），HO样仍主导；克隆交叉显示107个克隆跨HO与FO/VPM、57个跨HO与FO/dLG，仅19个克隆同时贡献VPM和dLG而无HO；谱系耦合分析显示HO与各FO强耦合，FO/VPM与FO/dLG直接耦合弱；早期混合HO共表达外侧后核（lateral posterior, LP）与后内侧核（posteromedial, Po）标记，后解析LP/Po，混合HO克隆贡献LP/Po/dLG/VPM。结论：HO样状态是允许性中间态，可贡献多个FO轨迹，而非单一命运限制前体。

（4）Sp9通过谱系特异转录控制定义视觉丘脑身份（Sp9 defines visual thalamic identity through lineage-specific transcriptional control）。GRN显示视觉dLG轨迹富集Sp9、Zic1、Zic4，VPM富集Nr2f1、Tshz1、Rorb；Sp9早期祖细胞表达后限制于dLG，dLG中启动子可及性升高而VPM不可及；Sp9调控Gbx2、Zic1、Zic4、Pou2f2、Lhx9；E11.5 CRISPRi–Sp9至P0显示dLG面积、DAPI⁺细胞密度及Sp9⁺GFP⁺细胞减少，qPCR/免疫组化确认敲低；snRNA-seq显示dLG神经元耗竭及FO向HO程序偏移；显微切割dLG的snRNA-seq显示RNA加工、翻译和突触组织基因下调。结论：Sp9是dLG形成和视觉丘脑身份所需的谱系限制调控因子，并促进FO感觉程序巩固。

讨论部分总结：研究提出丘脑感觉相关与运动关联环路来自两条早期分叉、谱系受限轨迹，受不同转录程序和时间动态控制；感觉支内FO躯体感觉和视觉神经元来自共同祖池，先经历HO样状态再分化为FO亚类。该模型区别于将HO与FO感觉核归于分开祖池的模型，并与人类丘脑共享祖池的发现一致；研究还揭示谱系特异异时性，即感觉谱系较早分化、运动关联谱系延迟成熟。Sp9被确定为视觉丘脑身份谱系特异调控因子，其缺失使FO程序向HO样状态偏移并影响dLG成熟。意义在于提供丘脑模态特化的统一发育框架，并将谱系特异TF和调控模块与神经发育障碍中的丘脑环路功能障碍相联系。研究结论翻译：总之，研究人员定义了丘脑环路特化背后的转录和谱系逻辑；该框架细化了对感觉脑发育的理解，并为将发育程序与环路功能及功能障碍相联系提供了分子基础。