结直肠腺瘤-癌进展中阶段相关SERPINF1、NFATC2和LGALS9及免疫特征的转录组分析与初步体外扰动研究

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Stage-associated SERPINF1, NFATC2, and LGALS9 and immune features in colorectal adenoma-carcinoma progression: Transcriptomic analysis and pilot in vitro perturbation

　　

背景：腺瘤-癌序列涉及上皮与微环境的协同变化，但SERPINF1/PEDF（pigment epithelium-derived factor，色素上皮衍生因子）-NFATC2（nuclear factor of activated T cells 2，活化T细胞核因子2）-LGALS9（galectin-9，半乳糖凝集素-9）关系尚未在结直肠上皮中建立。研究人员将阶段分辨的公共转录组系列与HT29结直肠腺癌细胞、成纤维细胞和CD8⁺ T细胞中的初步扰动实验进行整合。方法：分析GSE41657（正常黏膜、低级别腺瘤、高级别腺瘤和腺癌；n=12/21/30/25）的四阶段异质性、预设复合评分、相关性以及高级别与低级别对比。HT29细胞接受si-PEDF，联合或不联合INCA-6（钙调神经磷酸酶-NFAT相互作用抑制剂）。条件培养基实验比较si-NC-CM与si-PEDF-CM。初步实验数值根据图中分组汇总近似报告。结果：SERPINF1、LGALS9和NFATC2显示四阶段异质性（Kruskal-Wallis P=1.90×10^?7、3.48×10^?4和3.49×10^?3），但在高级别与低级别腺瘤直接比较中均未达到FDR（false discovery rate，错误发现率）显著性。来源定义的CAF（cancer-associated fibroblast，癌相关成纤维细胞）和ECM（extracellular matrix，细胞外基质）评分也随阶段不同；高级别与低级别腺瘤显示来源报告的AKT差异为+0.427（FDR=0.030），细胞毒性T细胞差异为?0.401（FDR=0.030）。SERPINF1与LGALS9在病变组织中不相关（rho=?0.004，P=0.969）。在HT29细胞中，si-PEDF伴随SERPINF1 mRNA降低以及LGALS9 mRNA和NFATc2蛋白信号升高；INCA-6条件减弱LGALS9和NFATc2变化。si-PEDF-CM增加成纤维细胞α-SMA（alpha-smooth muscle actin，α-平滑肌肌动蛋白）和FAP（fibroblast activation protein，成纤维细胞活化蛋白）信号，并使IFN-γ⁺Granzyme B⁺ CD8⁺细胞从约42.7%降至19.4%。PD-1⁺TIM-3⁺细胞也从约23.0%降至11.0%。结论：数据识别阶段相关组织块模式及HT29细胞中对PEDF扰动的NFAT相关上皮反应。它们未建立转变特异性信号开关、NFATC2特异性转录控制或LGALS9介导的基质或免疫效应。IFN-γ⁺Granzyme B⁺和PD-1⁺TIM-3⁺ CD8⁺群体同时降低更符合急性T细胞状态改变，而非经典检查点定义的耗竭表型。

研究背景：结直肠癌通常经组织学可识别的腺瘤-癌序列发生，分子异常在明显侵袭前累积。基因表达谱分析发现染色体不稳定、代谢、组织衰老和恶性进展沿该序列出现协调变化；单细胞和空间分析显示人结直肠息肉中癌前上皮程序伴随免疫和基质区室重塑；腺瘤进展风险相关转录特征已被识别，整合基因组和转录组工作提示腺瘤可已共享结直肠癌中观察到的程序，而富基质状态在侵袭前较少见。PEDF由SERPINF1编码，为分泌型多功能蛋白，具有抗血管生成和肿瘤相关功能；在内皮细胞中，PEDF被报道通过促进NFATc2胞质滞留和核输出并降低NFAT依赖转录来抑制NFAT信号。INCA-6最初被表征为阻断钙调神经磷酸酶-NFAT结合的小分子，而非NFATC2选择性试剂，因此结直肠上皮模型中的抑制剂推断涉及广义钙调神经磷酸酶-NFAT信号。LGALS9编码galectin-9，具有肿瘤细胞和免疫调节功能；NFATc2已被显示结合LGALS9调控区并增加肺腺癌中galectin-9表达；在结直肠癌中，LGALS9启动子表观遗传调控与多个免疫检查点基因调控已被描述，galectin-9表达也与成熟树突细胞浸润及结直肠肿瘤T细胞免疫特征相关，TIM-3等检查点受体和配体存在于结直肠癌微环境。由于PEDF依赖NFAT调控在内皮细胞描述、NFATC2依赖LGALS9调控在肺腺癌证明，二者在结直肠上皮细胞中的耦合属于跨背景假设。公共GSE41657系列包含正常黏膜、低级别腺瘤、高级别腺瘤和腺癌标本，高级别类别包括重度异型增生或原位癌；锯齿状前驱病变未作为单独类别，解释限于该队列代表的腺瘤基础病变谱。因此，研究人员将公共队列与聚焦HT29扰动模型结合，检查两个证据层是否显示一致关联；SERPINF1 mRNA和细胞PEDF免疫荧光被测量，而条件培养基中分泌PEDF浓度未量化。

关键技术方法（不超过250字）：公共转录组GSE41657（GPL6480；正常黏膜12例、低级别腺瘤21例、高级别腺瘤30例、腺癌25例）用于四阶段异质性、预设复合评分、Spearman相关、limma经验贝叶斯与Benjamini-Hochberg校正及PCA；HT29（ATCC HTB-38）行si-NC、si-PEDF、si-PEDF+INCA-6（10 μmol/L）处理，条件培养基处理CCD-18Co（ATCC CRL-1459）和3名健康成人外周CD8⁺ T细胞；采用qRT-PCR、免疫荧光和流式细胞术。

研究结果：
3.1 GSE41657提供从正常黏膜到腺癌的四阶段转录组系列：对88例标本进行主成分分析作为全局表达结构探索，正常黏膜样本形成视觉上更分离的簇，而低级别和高级别腺瘤明显重叠。
3.2 SERPINF1、LGALS9和NFATC2显示阶段相关表达差异，但无高级别腺瘤特异性核心轴偏移：四组Kruskal-Wallis检验显示三者均存在显著异质性，但直接高级别与低级别腺瘤比较均未达FDR显著性，反对该三基因集存在离散高级别特异性开关。
3.3 组织块共变异不支持SERPINF1-LGALS9反向关系：在腺瘤和腺癌标本中Spearman相关显示SERPINF1与LGALS9不相关；SERPINF1与NFATC2、ACTA2、FAP和HAVCR2呈正相关，但这些相关来自混合细胞区室，且相关P值未记录多重校正，按探索性处理。
3.4 来源定义的基质和ECM复合评分跨系列不同，腺瘤级别间存在AKT评分差异：CAF活化和ECM重塑复合评分在四组间不同；来源报告的高级别与低级别比较中AKT评分差异为+0.427（FDR=0.030），ECM重塑差异为+0.205（FDR=0.070）。
3.5 来源定义的T细胞和NFAT相关复合评分跨阶段不同：T细胞耗竭、细胞毒性T细胞和NFAT活性复合评分在四阶段系列中不同；来源报告的高级别与低级别腺瘤比较中细胞毒性T细胞评分差异为?0.401（FDR=0.030）。
3.6 高级别与低级别腺瘤比较识别AKT和细胞毒性T细胞评分差异：差异表达分析和靶向评分输出显示高级别腺瘤AKT评分较高、细胞毒性T细胞评分较低，ECM重塑评分差异未达FDR阈值。
3.7 PEDF沉默伴随LGALS9和NFATc2信号升高，INCA-6条件减弱该变化：qRT-PCR和免疫荧光显示si-PEDF后SERPINF1 mRNA降低、LGALS9 mRNA及PEDF和LGALS9免疫荧光改变，总NFATc2免疫荧光信号升高；INCA-6条件减弱si-PEDF相关LGALS9和总NFATc2信号增加，但实验未建立NFATC2特异性转录救援，G3中SERPINF1 mRNA较高未解释为机制性救援。
3.8 si-PEDF-CM与CCD-18Co成纤维细胞CAF样标志物转变相关：条件培养基暴露后，CCD-18Co细胞α-SMA和FAP免疫荧光较si-NC-CM升高；该结果支持有限激活标志物表型，不建立更广泛功能性CAF状态或特定CAF亚型。
3.9 si-PEDF-CM与CD8⁺效应和PD-1⁺TIM-3⁺双阳性频率降低相关：流式细胞术显示si-PEDF-CM使IFN-γ⁺Granzyme B⁺ CD8⁺细胞由约42.7%降至19.4%，PD-1⁺TIM-3⁺细胞由约23.0%降至11.0%；效应和检查点双阳性群体平行降低不支持经典PD-1/TIM-3定义耗竭简单增加。

讨论部分总结：转录组分析显示SERPINF1、LGALS9和NFATC2存在四阶段异质性，但直接高级别与低级别腺瘤比较均未达FDR显著性，结合低级别和高级别腺瘤在PCA中重叠，反对级别转换处存在离散核心基因开关。HT29实验回答不同问题，即结直肠癌细胞中PEDF扰动是否影响LGALS9和NFAT相关读数；PEDF沉默伴随LGALS9和总NFATc2信号升高，INCA-6条件减弱这些变化，但因INCA-6广泛破坏钙调神经磷酸酶-NFAT结合，结果支持NFAT相关反应而未识别NFATC2为负责亚型，总NFATc2免疫荧光也不能替代核转位或磷酸化直接测量。组织块相关需谨慎解释：SERPINF1与LGALS9在腺瘤和癌标本中基本不相关，而SERPINF1与NFATC2、ACTA2、FAP和HAVCR2正相关，这些关系来自混合上皮、基质和免疫区室，不能视为直接细胞内在调控；SERPINF1与ACTA2和FAP的正相关与条件培养基实验中si-PEDF-CM增加成纤维细胞α-SMA和FAP信号方向不同，因此视为生物学不同而非相互验证；下游实验仅用si-NC-CM和si-PEDF-CM，未检测NFAT依赖性，galectin-9未被直接中和或操纵，其作为条件培养基效应介质的作用未解决。PEDF在结直肠癌中有直接先例：Harries et al.报告结直肠肿瘤组织PEDF表达较低及重组PEDF对结直肠癌细胞迁移、侵袭和黏附的影响；Nwani et al.在黑色素瘤中显示成纤维细胞PEDF影响CAF样特性；Qin et al.在肺纤维化模型中报告PEDF对成纤维细胞活化的抗纤维化作用；这些为跨组织机制先例，而非结直肠肿瘤中PEDF依赖CAF机制的验证。Koncina et al.识别具有免疫抑制特性的功能不同成纤维细胞状态；因此α-SMA和FAP升高支持有限激活标志物表型，不定义独特CAF亚型、不建立基质重塑或更广泛功能性CAF状态。复合评分提供阶段相关背景但不应过度解释：名称描述原始分析特征，当前分析包缺乏明确基因列表限制通路水平可重复性；Kruskal-Wallis检验说明组间异质性而非序列中一致升高或降低；GSE41657潜在患者匹配及原工作流缺乏个体水平阻断增加标本水平P值不确定性；公共队列发现宜视为识别上皮、基质和免疫读数趋同或分离的探索性框架，而非单一进展通路证据。CD8⁺实验为外周细胞急性72 h条件培养基暴露，不同于肿瘤浸润耗竭T细胞的慢性抗原暴露和分化史；IFN-γ⁺Granzyme B⁺比例降低说明测试条件下效应输出降低，同时PD-1⁺TIM-3⁺细胞降低反对简单检查点定义耗竭模型；galectin-9可与PD-1和TIM-3相互作用并调节T细胞存活，但下游实验未直接扰动galectin-9，因此数据支持急性分泌组相关CD8⁺表型改变而未指定特定耗竭机制。总体而言，研究将阶段相关转录组变异与聚焦上皮扰动模型及两个下游条件培养基读数联系起来，最强实验观察是HT29细胞PEDF沉默伴随LGALS9和总NFATc2信号增加，而钙调神经磷酸酶-NFAT抑制减弱这些变化；成纤维细胞和CD8⁺发现将表型延伸至细胞外环境，但未建立NFAT依赖下游信号或LGALS9介导因果；单公共队列、单癌细胞系和若干复合及细胞读数定义有限，解释所提出PEDF-NFAT-LGALS9关系泛化性时需考虑。

研究结论翻译：数据识别阶段相关组织块模式和HT29细胞中对PEDF扰动的NFAT相关上皮反应；它们未建立转变特异性信号开关、NFATC2特异性转录控制或LGALS9介导的基质或免疫效应；IFN-γ⁺Granzyme B⁺和PD-1⁺TIM-3⁺ CD8⁺群体同时降低更符合急性T细胞状态改变，而非经典检查点定义的耗竭表型。