基于外切核酸酶门控CRISPR/Cas12a生物传感策略的lncRNA MIR155HG灵敏检测方法

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Exonuclease-Gated CRISPR/Cas12a Biosensing Strategy for Sensitive Detection of lncRNA MIR155HG

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  一种Exo I门控的CRISPR/Cas12a生物传感器检测长非编码RNA MIR155HG。
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  Exo I介导的探针调控降低了背景CRISPR/Cas12a激活。
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  CRISPR/Cas12a反式切割实现了灵敏的荧光信号放大。
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  模块化的ssDNA探针设计支持细胞外lncRNA分析。
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  该检测方法在复杂生物环境中表现出可靠的性能。

引言

长非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸且不具有蛋白质编码能力的转录本[1], [2]。越来越多的证据表明，lncRNA在表观遗传、转录和转录后等多个生物学过程中发挥着重要的调控作用[3], [4], [5], [6]。通过调控基因表达，lncRNA参与剂量补偿、基因组印记、细胞分化和细胞应激反应，从而维持细胞稳态[7], [8], [9], [10]。在众多已鉴定的lncRNA中，MIR155宿主基因（MIR155HG）被发现与多种恶性肿瘤有关。MIR155HG在宫颈癌组织中显著上调，并被证实可促进肿瘤相关的细胞表型[11], [12]。MIR155HG的表达水平与肿瘤进展相关，表明其具有作为生物标志物分析的潜在价值[13]。因此，灵敏可靠的MIR155HG检测方法将有助于其作为疾病相关分子标志物的进一步研究。

近年来，基于CRISPR/Cas12a的核酸检测技术在分子诊断领域引起了广泛关注，这得益于其高灵敏度和序列特异性[14], [15], [16]。在各种CRISPR-Cas系统中，CRISPR/Cas12a因其反式切割活性而被广泛用于生物传感[17]。CRISPR/Cas12a通过CRISPR/Cas12a RNA（crRNA）引导复合物识别靶标核酸后，被激活并以非特异性方式切割周围单链DNA（ssDNA）报告分子[18]。这种反式切割活性使得靶标识别可转化为可检测的荧光信号。基于此特性，CRISPR/Cas12a已与应用滚动环扩增（RCA）、杂交链式反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）等扩增策略相结合，以进一步提高检测灵敏度[19], [20], [21, [22]。然而，这些方法依赖于额外的核酸扩增步骤或复杂的探针设计，增加了实验流程的复杂性，并可能引入非特异性扩增和背景信号[23], [24]。

CRISPR/Cas12a已被应用于ncRNA检测，包括miRNA、piRNA和lncRNA，通常与RCA、HCR或CHA联用以提高灵敏度[25], [26]。无扩增RNA检测也已利用分裂激活型设计得到实现[27], [28]。然而，CRISPR/Cas12a被RNA激活的过程受靶标长度、序列背景和RNA结构的影响，这可能会限制对长RNA或高度结构化的RNA的直接检测[29], [30]。利用电化学和无扩增辅助生物传感器，细胞外lncRNA的直接检测也已实现，例如血浆中无扩增的HOTAIR检测以及基于探针的肝细胞癌及其他lncRNA检测[31], [32], [33]。然而，这些方法通常需要多步样品处理、复杂的探针或电极设计、酶介导的信号放大或额外的核酸扩增。

此前，核酸外切酶保护已被与CRISPR/Cas12a偶联用于生物传感。Exo III介导的DNA激活剂保护被用于转录因子检测，其中靶标结合保护了激活剂，从而实现了CRISPR/Cas12a的激活[34]。随后，Kang将Exo I介导的靶标保护与T7转录相结合，其中受保护的转录模板产生crRNA，用于下游CRISPR/Cas12a激活以检测miRNA、蛋白质和外泌体[35]。与这些设计不同，本策略将lncRNA诱导的ssDNA探针保护直接偶联至CRISPR/Cas12a激活，无需中间转录或核酸预扩增步骤。这为细胞外lncRNA的分析提供了一种更直接的信号转换途径。

在此基础上，我们致力于开发一种CRISPR/Cas12a策略，将lncRNA识别直接与荧光产生偶联，同时最大限度减少额外的扩增和信号转换步骤。大肠杆菌核酸外切酶I（Exo I）以高度延伸的方式沿3'到5'方向降解ssDNA[36]。一旦3'识别区与MIR155HG杂交，RNA-DNA杂合结构降低了探针被Exo I消化的敏感性，从而增加了保留CRISPR/Cas12a激活序列的概率。基于此原理，我们开发了一种核酸外切酶门控的CRISPR/Cas12a检测策略。

在不存在MIR155HG的情况下，探针被Exo I降解，导致CRISPR/Cas12a激活有限，背景荧光较低。在存在MIR155HG的情况下，靶RNA与探针的识别区形成特异性RNA-DNA杂合链，限制了3'末端的降解位点，使激活序列得以保留。探针激活CRISPR/Cas12a，后者切割荧光淬灭报告分子（FQ-reporter），产生放大的荧光信号。通过将Exo I介导的探针调控与CRISPR/Cas12a反式切割相结合，E-CRISPR提供了一种无扩增的MIR155HG检测方法，并可能为细胞外lncRNA分析提供有用的框架。

章节摘录

材料与试剂

本实验中使用的所有DNA和RNA序列均购自 Sangon Biotechnology（中国上海）有限公司。详细的序列信息见补充信息中的表S1。Exo I和10× CutSmart Buffer购自New England Biolabs（中国北京）。EnGen? Lba Cas12a（Cpf1）和10× NEBuffer 2.1也购自同一供应商。无RNase水和100?mM MgSO?溶液由碧云天生物科技公司（中国上海）提供。超纯

E-CRISPR检测法用于lncRNA分析的原理

如图1所示，本研究建立了一个基于Exo I介导的探针调控和CRISPR/Cas12a反式切割的E-CRISPR检测系统，用于灵敏检测lncRNA MIR155HG。该系统的核心是一种双功能ssDNA探针，包含两个功能区域：3'末端的MIR155HG识别序列和CRISPR/Cas12a激活序列。3'识别区与MIR155HG互补，而另一端则作为CRISPR/Cas12a激活元件。

结论

E-CRISPR通过将靶标诱导的双功能ssDNA探针保护与CRISPR/Cas12a激活偶联，提供了一种无扩增的lncRNA检测策略。与依赖扩增的方法相比，它简化了实验流程，避免了额外的扩增或基于转录的信号转换，并保留了单碱基分辨能力和在稀释血清中的可靠性能。然而，该方法目前主要对MIR155HG进行了验证，需要更大规模的进一步研究

作者贡献声明（CRediT）

Qiufeng Wang（王秋峰）：初稿撰写、验证、方法学、调查研究、概念构思。 Yongliang Cai（蔡永良）：验证、调查研究。 Yihao Jiang（江以豪）：调查研究。 Heliang Sun（孙和亮）：调查研究。 Shiyu Zhu（朱诗雨）：调查研究。 Feifan Yin（尹菲菲）：方法学。 Yang Xiang（向洋）：审稿与编辑、监督、方法学。 Zhongyun Wang（王忠云）：方法学、经费获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究受国家自然科学基金（资助号：82371283、82571445、81672570）和国家天然仿生药物重点实验室（资助号：K202009）支持。

Qiufeng Wang|Yongliang Cai|Shiyu Zhu|Feifan Yin|Yihao Jiang|Heliang Sun|Yang Xiang|Zhongyun Wang