13C与31P稳态自由进动技术结合大口径NMR探头在水生生物活体内过程监测中的应用潜力

《Journal of Magnetic Resonance》：The potential of 13C and 31P steady state free precession in combination with large diameter NMR probes for in vivo process monitoring in aquatic organisms

　　摘要- 稳态自由进动（SSFP）可为低丰度样品提供显著的灵敏度增强。- 大口径探头在活体核磁共振（NMR）研究中相比标准5毫米探头具有优势。- CRAFT是一种有效的技术，可缓解SSFP的局限性（即自由感应衰减截断）。- SSFP和大口径探头可在无同位素富集的情况下实现活体样品的过程监测。引言活体核磁共振（NMR）波谱学是一种强大的技术，可用于阐明生物体的分子结构和相互作用[1]，[2]，[3]。作为一种无损技术，它提供了实时研究生物体的能力，其中生物体充当"终极生物传感器"，报告代谢、生长和应激等关键过程[1]，[4]，[5]，[6]。尽管具有高度优势，活体NMR仍面临若干挑战。生物体非常复杂且具有异质性，导致光谱重叠和谱线展宽[1]，[5]。使用大口径探头进行1H NMR研究尤为困难，因为水信号强度大，抑制困难。相比之下，碳具有巨大潜力，因为它普遍存在于所有有机结构中，且具有较宽的化学位移分散范围（13C 0–200 ppm 对比 1H 0–10 ppm）。然而，天然丰度低（例如，1.1% 13C 对比 98.9% 12C）使得对生物体进行13C NMR研究具有挑战性[1]，[7]，[8]，[9]，[10]。提高样品灵敏度的一种方法是13C富集，然而13C富集食品（即13C富集藻类）成本的上升使得这种方法在经济上不可行，尤其是对于较大的生物体[11]，[12]，[13]。大口径探头在活体NMR研究中具有相当大的潜力，因为较大的容积可提供额外的生物量，这有助于抵消富集的需求[1]，[2]，[13]，[14]，[15]。大口径探头通常采用"观测"式探头设计，以X（或宽带线圈）作为内线圈。传统的观测式设计还能改善X核的信号，相对于"反演"式探头（X线圈在外侧），为13C等低灵敏度核素提供了额外优势[15]。此外，与1H相比，31P和13C检测实验通常具有更宽的化学位移分散范围，这有望减少重叠并检测非质子化位置[10]，[15]。此外，异核NMR不存在强烈的水信号，该信号通常会掩盖1H活体NMR光谱中的重要峰。因此，无需使用高级水抑制技术，而非专家用户实施这些技术可能具有挑战性[5]，[15]。然而，尽管有额外的容积和观测式设计，早期使用大口径探头进行的活体NMR研究通常包括1H和31P，因为相对于13C，它们的丰度和灵敏度更高[14]，[16]，[17]，[18]。一种提高大口径探头活体NMR灵敏度和可行性的技术是稳态自由进动（SSFP）实验[19]，[20]，[21]，[22]。SSFP是一种独特的方法，利用短时间内进行数百次扫描。自旋受到一系列快速射频（RF）脉冲的作用，具有相同的翻转角和短于横向弛豫时间（T2）的脉冲间时间（Tp）[19]，[20]，[21]。这种快速采集使信号维持在横向平面中，其幅度永远不会衰减至零（即达到稳态），自由感应衰减（FID）的最强区域被连续采样[19]，[20]，[21]。通过在整个采集过程中将自旋维持在稳态，可实现大量扫描，从而提高灵敏度。虽然SSFP是一种在不牺牲实验时间的情况下提高信噪比（SNR）的出色技术，但会产生截断的FID，导致傅里叶变换时出现截断伪影[19]，[21]。有趣的是，在自然表现出宽谱线的异质系统（如生物体）中，这种影响微乎其微[20]，[23]。如果需要恢复非常尖锐的信号，则可以通过幅度频率表完整还原（CRAFT）来缓解SSFP的局限性。CRAFT是一种基于贝叶斯分析的非傅里叶方法，在时域中对关键NMR参数（即频率、衰减率、相位和幅度）进行建模，并直接从FID中提取所有信号，以表格形式存储[21]，[24]。虽然CRAFT表可以直接使用，但通常将其模拟为光谱格式，以便与传统FT结果进行比较[20]，[21]，[24]。有关CRAFT处理的更多信息，读者可查阅最近的综述，其中讨论了分析和可视化NMR数据的各方面内容[24]。CRAFT的一个有趣功能是能够利用已知的衰减率，将其外推超出截断FID的末端，使模拟光谱中呈现自然的谱线形状。这种方法在本工作末尾进行了演示，非常适合恢复在SSFP中通过截断而展宽的更尖锐的信号。本研究将展示SSFP和大口径探头在活体NMR过程监测中的潜力，并在各种生物系统上展示应用。首先，连续采集31P SSFP以研究*Artemia franciscana*（卤虫）幼体在出生后的原位生长发育过程，其中高能磷酸化合物（如ATP）的变化提供了孵化出休眠卵后能量过程和需求的洞察。接下来利用13C SSFP NMR研究盐度对卤虫幼体的影响。采用批量处理方法，将同一组卤虫暴露于不同盐度中。批量方法允许研究离散的盐浓度，并深入了解生物体如何应对盐度的突然变化。随后进行了一项研究，展示了在连续采样系列中，如何通过仔细的实验设计区分温度变化与生长的影响。施加了复杂的非线性温度变化，并使用统计方法区分出与温度变化相关的代谢物。这在一定程度上与复杂的现代原位监测过程相一致，其中通常存在多个混杂变量。最后，"未来方向"部分探讨了更大的定制20毫米探头的潜力，用于研究超出10毫米探头尺寸范围的大型生物体，并展示CRAFT处理的潜力。测试了三种不同的生物体，以展示20毫米探头用于活体NMR的广泛应用。这包括用于海洋系统的*Entacmaea Quadricolor*（海葵）、用于淡水系统的*Staurogyne Repens*（水马齿）和用于陆地系统的*Eisenia fetida*（蚯蚓）。章节摘要*Artemia franciscana*培养*A. franciscana*休眠卵最初购自Brine Shrimp Direct（美国犹他州）。孵化设置按照食品与农业组织的标准孵化程序进行[25]。简而言之，卤虫休眠卵在装有25,000 mg/L盐溶液的锥形瓶中孵化24小时。锥形瓶在室温下使用气泵充分通气。卤虫幼体（即新孵化幼虫）用于该生物体的所有测试。*Eisenia fetida*培养*E.*SSFP作为活体NMR灵敏度增强工具活体生物体含有多种成分（即生物组织、不同的身体器官和结构），其异质性在样品中产生不同的磁化率，导致谱线展宽和低信噪比[1]，[2]，[12]，[13]。一种无需样品富集即可增强信号的方法是使用大口径探头。例如，10毫米探头比标准5毫米NMR探头提供约4倍的容积，额外的生物量可以SSFP-CRAFT用于活体NMR的潜力CRAFT是一种有效的技术，可缓解SSFP实验的局限性（即光谱截断），并恢复在生物和异质样品中通过截断而在SSFP中被衰减的尖锐信号。图5突出了SSFP-CRAFT的优势，使用10毫米探头对蚯蚓进行31P SSFP展示了这一点。如预期，与标准31P（图5A）在相同实验时间下相比，31P SSFP（图5B）提供了信噪比优势。然而，图5B中的SSFP光谱结论本研究展示了使用10毫米和20毫米大口径探头进行SSFP实验在评估和监测各种生物体过程中的潜力和应用。SSFP提供了可观的信号增强，因为它允许在标准NMR扫描相同的采集时间内进行数百次扫描。当与提供额外生物量的大口径探头结合使用时，这为未富集生物体的活体NMR研究提供了关键优势。31PCRediT作者贡献声明**Peter M. Costa：** 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，方法论，形式化分析，数据整理，概念构思。**Daniel H. Lysak：** 撰写 – 审阅与编辑，数据整理，概念构思。**Daniel Schmidig：** 撰写 – 审阅与编辑，软件，资源。**Simon Gloor：** 撰写 – 审阅与编辑，软件，资源。**Wolfgang Bermel：** 撰写 – 审阅与编辑，软件，方法论。**Krish Krishnamurthy：** 撰写 – 审阅与编辑，可视化，软件，资源，利益冲突声明作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：多伦多大学和其他学术机构没有利益冲突需要声明。Bruker BioSpin制造了研究中使用的NMR技术。Mestrelab、Chempacker和Open VnmrJ Solutions提供了工作中使用的软件工具。没有任何商业方影响了本研究的数据收集、解释或结论。致谢我们感谢加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）[联盟项目（ALLRP 549399），联盟项目（ALLRP 555452），联盟项目（ALLRP 597702），发现计划（RGPIN-2019-04165，RGPIN-2025-04574）]，加拿大创新基金（CFI-12506），安大略省研究与创新部（MRI-12506）以及秘鲁天主教大学（PUCP）研究副校长办公室通过DRI-2025-1290拨款提供的支持。Peter M. Costa | Daniel H. Lysak | Daniel Schmidig | Simon Gloor | Wolfgang Bermel | Krish Krishnamurthy | Dan Iverson | Flavio V.C. Kock | Myrna Simpson | Andre Simpson