《Journal of Membrane Science》：Vibration-assisted tangential flow filtration using charged membranes for production of highly concentrated siRNA formulations
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•带电UF膜由于排斥相互作用而表现出更好的性能••使用振动加带电膜组合，可实现的最大siRNA浓度提高至230 mg/mL••仅使用振动在中等siRNA浓度时增加了通量，这是由于siRNA的取向排列••通过流变学测量独立证实了siRNA取向排列的存在••在所研究条件下，振动辅
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带电UF膜由于排斥相互作用而表现出更好的性能
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•使用振动加带电膜组合，可实现的最大siRNA浓度提高至230 mg/mL
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•仅使用振动在中等siRNA浓度时增加了通量，这是由于siRNA的取向排列
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•通过流变学测量独立证实了siRNA取向排列的存在
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•在所研究条件下，振动辅助过滤对siRNA的完整性没有负面影响
引言
切向流超滤（TFF）是广泛用于多种生物制药产品最终浓缩和配方的首选方法，包括单克隆抗体[1]、重组蛋白如胰岛素[2]、信使RNA疫苗[3]、腺相关病毒（AAV）基因疗法[4]以及许多其他产品。TFF通常对生物产品的降解或聚集影响极小，并且该技术可以很容易地从工艺开发扩展到大规模商业生产[5]。
尽管TFF在生物制造中取得了广泛的成效，但在许多情况下，超滤过程存在滤液通量极低和/或无法达到目标最终浓度的问题。这一现象在单克隆抗体（mAbs）的研究中最为广泛，其最终配方通常要求浓度超过200 mg/mL，以便通过单次皮下注射提供有效治疗剂量。例如，Baek等人[6]报道了Fc融合蛋白在25 mM组氨酸缓冲液加600 mM蔗糖条件下的TFF数据，可实现的最大浓度低于200 mg/mL。Winter[7]报道了重组人源mAb的超滤数据，其中标准TFF操作条件由于mAb的高粘度而无法达到110 mg/mL的目标最终浓度；只有在升高温度（约45oC）以降低粘度时才能实现目标浓度。最近，Banik等人[8]表明，使用商业超滤膜进行TFF无法将小干扰RNA（siRNA）药物浓缩到超过70 mg/mL，远低于siRNA皮下递送所需的配方浓度。
已探索了多种不同的策略来克服TFF应用中观察到的局限性。其中包括使用各种降低粘度的赋形剂，如精氨酸、组氨酸和NaCl[9]，其中许多已被证明可以增加可实现的最大mAb浓度[10]。然而，这些添加剂可能不适用于最终配方，可能导致聚集或降解加剧[11]。Lutz等人[12]描述了开发具有更开放或悬浮筛网的TFF模块，专门设计用于容纳高粘度蛋白质溶液。这些模块确实可以实现更高的最终浓度，但代价是UF过程中滤液通量的显著降低。例如，配备悬浮V型筛网的TFF模块在蛋白质浓度为40 mg/mL时通量仅为25 L/m2/h，而使用更传统的筛网在相同条件下通量超过55 L/m2/h。
另一种增加滤液通量的方法是使用振动辅助过滤系统来减少浓差极化和污堵程度。首次记录的振动膜应用是1992年由Armando等人在New Logics公司完成的，这导致了振动剪切增强处理（VSEP）的商业化[24]。Kertesz等人[13]发现，使用VSEP Series-L模块超滤乳品废水时，渗透液通量比无振动条件下增加了44%。虽然振动在工业和环境系统中已被广泛探索作为抗污堵策略，但在生物加工领域几乎没有应用。最近，Behboudi等人[14]表明，Vibro-Lab 35P系统（来自Sani Membranes）中的振动使信使RNA产品的单次通过切向流过滤（SPTFF）临界通量提高了3倍以上，且产品完整性没有损失。Piash等人[15]在同一系统中对人血清免疫球蛋白G进行SPTFF时获得了类似结果。然而，这些研究均未考察振动过滤是否能在超滤过程中增加可实现的最大浓度，而许多生物治疗药物所需的浓缩产品配方正是要求这一点。
本研究的目标是考察Vibro-Lab 35P系统用于浓缩siRNA产品的性能。siRNA是一种双链核酸，可以结合并特异性降解mRNA中的致病序列，提供了一种先进的治疗模式，可以靶向传统上"不可成药"的疾病[16]，包括心血管疾病和神经退行性疾病等慢性病的治療[17]、[18]。我们实验室最近的研究表明，使用带负电荷的复合再生纤维素膜可将可实现的最大siRNA浓度从70 mg/mL提高到接近180 mg/mL，这是由于带负电荷的siRNA受到静电排斥作用所致，但最大浓度仍低于许多治疗应用所需的200 mg/mL目标。我们的假设是，这种静电排斥与Vibro-Lab 35P系统中的剪切增强振动运动的结合，可以减少TFF过程中的浓差极化和污堵效应，从而更大程度地增加可实现的最大siRNA浓度。因此，本研究首次展示了振动与膜电荷对UF性能协同效应的实验证据。
章节摘要
siRNA
本实验所用siRNA的分子量经尺寸排阻色谱-多角度光散射测定为17.15 kDa[8]。库存siRNA溶液（21 mg/mL）由Eli Lilly and Company（印第安纳州印第安纳波利斯）提供，在4 下保存，使用前平衡至室温。库存液可直接用于过滤，或在某些情况下将先前浓缩的材料（TFF后获得）用Milli-Q水稀释至所需的siRNA
膜电荷改性
图2展示了XPS光谱：(1)未经改性的干燥商业膜（原始状态），(2)使用异丙醇洗涤后用去离子水清洗以去除储存剂的未改性膜（在所有过滤实验前均如此操作），以及(3)使用3-溴丙磺酸配体制备的改性膜。168 eV处的峰对应于磺酸基团结合所涉及的硫的束缚能。该峰在未经改性的
结论
本研究首次提供了带电膜与振动结合用于siRNA药物超滤的实验数据。电泳测定表明振动对siRNA完整性没有影响。带电膜的静电排斥与振动的结合实现了230 mg/mL的最终siRNA浓度，这是siRNA超滤所报道的最高浓度。这是首项研究
CRediT作者贡献声明
Michelle Carter：写作 – 审阅与编辑，资源，方法论，资金获取。Ken K. Qian：写作 – 审阅与编辑，资源，方法论，资金获取。Km Prottoy Shariar Piash：写作 – 审阅与编辑，调查，形式分析，数据整理。McKensie L. Mason：写作 – 审阅与编辑，资源，方法论，资金获取。Ihita Banik：写作 – 初稿撰写，调查，形式分析，数据整理。Andrew L. Zydney：写作 – 审阅与
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述工作的客观性。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述工作的客观性。
致谢
本工作的支持由Eli Lilly and Company提供，该公司还提供了siRNA。作者还要感谢Ralph Colby博士和Sara Daryoush在流变学测量方面的帮助，以及Jeff Shallenberger进行的XPS分析。
Ihita Banik|Km Prottoy Shariar Piash|McKensie L. Mason|Michelle Carter|Ken K. Qian|Andrew L. Zydney
