《Cancer Medicine》：CBX4 and NOX4 Expression Are Associated With Chemoradiotherapy Response and Overall Survival in Locally Advanced Cervical Squamous Cell Carcinoma
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背景：组织生物标志物可能改善局部晚期宫颈癌在确定性同步放化疗（concurrent chemoradiotherapy，CCRT）前的风险分层。研究人员评估了治疗前chromobox 4（CBX4）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4
背景：组织生物标志物可能改善局部晚期宫颈癌在确定性同步放化疗（concurrent chemoradiotherapy，CCRT）前的风险分层。研究人员评估了治疗前chromobox 4（CBX4）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）、特异性蛋白1（specificity protein 1，SP1）和铜转运蛋白1（copper transporter 1，CTR1）表达与CCRT反应及总生存的关系。方法：在这项回顾性1:1匹配病例对照研究中，采用H评分（H-score）经AI辅助数字病理对40例局部晚期宫颈鳞状细胞癌患者（20例CCRT抵抗、20例CCRT敏感）的治疗前活检组织进行定量。通过表观受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线、留一交叉验证（leave-one-out cross-validation，LOOCV）、重复分层5折交叉验证（cross-validation，CV）和bootstrap乐观矫正评估简约CBX4 + NOX4 logistic（逻辑回归）模型。总生存分析为探索性。结果：CBX4和NOX4表达在CCRT抵抗肿瘤中较低（中位H评分：CBX4，40.47 vs. 79.62；NOX4，7.00 vs. 53.93；两者p < 0.001），而SP1和CTR1无差异。CBX4和NOX4的表观曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve，AUC）分别为0.840和0.843。两标志物模型的表观AUC为0.903，LOOCV AUC为0.845，重复5折CV AUC为0.854 ± 0.022，bootstrap矫正AUC为0.883。高CBX4和NOX4表达与更好的5年总生存相关；在联合Cox模型中，每增加1个标准差（standard deviation，SD）的风险比（hazard ratio，HR）分别为CBX4 0.31（95%置信区间[confidence interval，CI] 0.13–0.74）和NOX4 0.48（0.26–0.90）。未观察到组织化学可检测的铜沉积。结论：在这项小型、反应富集队列中，治疗前较低的CBX4和NOX4表达与CCRT抵抗表型和较差总生存相关。内部重采样提示具有判别能力，但同一数据集内的标志物选择可能引入残余乐观偏倚，且不能确立可推广性。在临床应用前需要在连续招募队列中进行独立验证。未确立涉及DNA修复、活性氧（reactive oxygen species，ROS）或放化疗敏感性的机制。
该研究聚焦局部晚期宫颈癌（locally advanced cervical cancer，LACC）在确定性同步放化疗（CCRT）前的风险分层问题。传统分期不能充分反映治疗反应的生物学异质性，治疗失败和复发仍是临床重要问题，因此有必要评估治疗前可测量的组织生物标志物。CBX4、NOX4、SP1和CTR1分别涉及染色质调控与DNA损伤反应、ROS生成、转录调控及铜转运/顺铂摄取等过程，但其与宫颈癌CCRT反应和总生存的关系尚需直接评估。基于此，研究人员开展了一项回顾性1:1匹配病例对照研究，纳入广西医科大学第一附属医院2015年1月至2023年10月治疗的40例局部晚期宫颈鳞状细胞癌患者，其中CCRT抵抗（CCRT-R）20例、CCRT敏感（CCRT-S）20例，评估治疗前CBX4、NOX4、SP1和CTR1表达与CCRT反应及总生存的关系，并构建简约CBX4 + NOX4判别模型进行内部验证。研究结论提示，治疗前较低的CBX4和NOX4表达与CCRT抵抗表型及较差总生存相关，但该模型为探索性、假设生成性，尚不能用于临床预测。其意义在于为LACC治疗前风险分层提供候选组织标志物和后续独立验证假设。
关键技术方法：该研究为回顾性1:1匹配病例对照研究，样本来自广西医科大学第一附属医院2015年1月至2023年10月治疗的40例局部晚期宫颈鳞状细胞癌患者（20例CCRT-R、20例CCRT-S）。治疗前宫颈活检组织经免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测CBX4、NOX4、SP1和CTR1，使用Aipathwell AI辅助数字病理平台定量H评分；另行赤藓红铜染色。统计分析在Python中完成，采用Mann–Whitney U检验、Fisher精确检验、Pearson相关、ROC AUC、LOOCV、重复分层5折交叉验证、bootstrap乐观矫正、Kaplan–Meier曲线、log-rank检验及联合Cox比例风险模型。
研究结果如下。3.1 基线特征：通过回顾性队列描述和组间比较显示，40例患者中位年龄53.0岁（四分位距[interquartile range，IQR] 46.0–59.0），各项基线比较均未达统计学显著；但CCRT-R组III–IV期比例更高（70% vs. 40%），提示小样本匹配后仍有残余不平衡；肿瘤直径中位4.2 vs. 4.0 cm（p = 0.747），淋巴结转移共4例（每组2例）。3.2 生物标志物表达与CCRT反应：通过治疗前活检IHC和AI辅助H评分比较发现，CBX4中位H评分在CCRT-R组为40.47（IQR 26.61–54.45），低于CCRT-S组的79.62（IQR 67.21–108.95）（p < 0.001）；NOX4为7.00（IQR 3.43–22.56） vs. 53.93（IQR 35.44–75.44）（p < 0.001）；SP1无差异（p = 0.695），CTR1呈CCRT-R组较低的非显著趋势（p = 0.068）。以CCRT-S = 1编码时，CBX4与敏感状态正相关（r = 0.564，p < 0.001），NOX4亦正相关（r = 0.565，p < 0.001），CTR1（r = 0.291，p = 0.069）和SP1（r = 0.036，p = 0.824）无显著相关；CBX4与NOX4相关（r = 0.423，p = 0.0066），SP1与CTR1相关（r = 0.403，p = 0.0099）。3.3 判别能力与内部验证：通过ROC和内部重采样评估显示，单个标志物表观AUC为CBX4 0.840、NOX4 0.843、CTR1 0.670、SP1 0.538；CBX4 + NOX4模型表观AUC为0.903，LOOCV AUC为0.845，100次重复分层5折交叉验证平均AUC为0.854 ± 0.022，bootstrap乐观矫正AUC为0.883。原四标志物模型表观AUC约0.900，但未优于CBX4 + NOX4，且重分析中重复交叉验证表现较弱；SP1和CTR1保留为候选标志物但未纳入修订的简约反应模型。3.4 探索性总生存分析：通过Kaplan–Meier和联合Cox模型显示，随访期间20例死亡均发生在CCRT-R组，反向Kaplan–Meier中位随访2689天（7.36年）；按中位H评分分组，CBX4高表达组5年总生存（overall survival，OS）高于低表达组（74.7% vs. 28.0%，log-rank p = 0.0038），NOX4高表达组亦高于低表达组（76.8% vs. 25.0%，p < 0.001）；SP1和CTR1与OS无显著关联。联合两标志物Cox模型中，标准化连续表达每增加1-SD的HR为CBX4 0.31（95% CI 0.13–0.74，p = 0.008）、NOX4 0.48（0.26–0.90，p = 0.023）。3.5 铜染色：通过赤藓红组织化学染色未在40例肿瘤标本中观察到可见深绿黑色铜沉积；该结果仅限组织化学可检测沉积，不能排除铜代谢改变或铜死亡相关通路活性。
讨论部分总结：该研究观察到治疗前CBX4/NOX4表达与反应定义的CCRT-R表型相关，两标志物模型表观AUC为0.903，但LOOCV降至0.845、重复5折交叉验证均值0.854、bootstrap矫正0.883，且标志物在同一数据集内选择，内部重采样不能完全消除模型选择偏倚，不能证明外部可推广性。CBX4部分强调，实验文献中的功能方向不能直接外推至宫颈癌，组织H评分不能确定CBX4对放化疗敏感性的方向或机制；NOX4部分强调ROS生物学具有背景依赖性，本研究未测ROS、氧化性DNA损伤、NOX4酶活性、DNA修复或下游氧化还原信号，因此不能证明NOX4衍生ROS导致放疗或顺铂增敏。模型性能部分指出，1:1按反应状态抽样使截距和预测概率不能解释为人群绝对风险，不支持据此设定分类阈值、治疗升级或常规临床实施，下一步需在足够样本、连续招募、尽量多中心的独立队列中验证预设CBX4 + NOX4模型及其系数，并评估校准和临床效用。SP1和CTR1未显示显著差异，加入模型未改善交叉验证判别，阴性结果不能排除40例样本不足以检测的小效应；铜沉积阴性解释应限于所用染色方法。局限性包括单中心40例、按反应状态等量选择、无独立验证、残余分期不平衡、未测临床和治疗混杂、20例死亡均在CCRT-R组、复发时间不完整、未进行功能干预。未来应连续招募独立患者、预指定两标志物特征和分析流程、收集完整分期/治疗实施/复发/生存信息，并开展功能实验判断CBX4或NOX4是否影响DNA修复、ROS信号或治疗敏感性。
研究结论部分翻译：在这个小型、回顾性选择的宫颈鳞状细胞癌队列中，治疗前较低的CBX4和NOX4表达与反应定义的CCRT抵抗表型及较差总生存相关。尽管探索性两标志物模型在内部重采样分析中保留了判别能力，但这些发现可能受标志物选择偏倚影响，且不能确立在新患者中的性能。在考虑临床使用前，需要在连续招募队列中进行独立验证。未证明CBX4、NOX4、DNA修复或ROS信号在放化疗反应中的因果作用。
