气相色谱-轨道阱质谱联用微透析技术：贴剂透皮成分非靶向分析的新方法

《Journal of Chromatography B》：GC-orbitrap-MS coupled with microdialysis: A novel approach for non-targeted analysis of transdermal constituents in topical patch preparation

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  建立了一种结合微透析技术与GC-Orbitrap-HRMS的综合平台。
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  在姜平贴（JPT）中鉴定了204种挥发性化合物（其中123种为新报道）。
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  确认了66种化合物为大鼠神阙穴的透皮成分。
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  揭示了三种不同的透皮特征模式（快速型/延迟型/持续型）。

引言

穴位贴敷疗法（AST）作为传统中医（TCM）的一种经典疗法，历经数千年的发展，已在世界各地广泛应用。穴位贴敷疗法以经络理论为指导，将中药膏药贴敷于特定穴位，其作用机制与现代经皮给药系统类似[1]。该疗法在治疗呼吸系统疾病（如哮喘）、消化系统疾病及各种疼痛病症方面显示出显著疗效[2]。与口服或注射制剂不同，穴位贴敷疗法通过皮肤递送中药成分，避免了肝脏首过效应并降低了全身毒性[3]，[4]。然而，角质层仍然是主要的屏障，通常会阻碍亲水性或高分子量化合物的渗透，而分子量低、油水平衡溶解度适中且熔点低的分子则更易透过。此外，中药膏贴含有多种成分，这些成分之间可能发生相互作用。例如，冰片可能会改变其他成分的透皮吸收[5]。因此，研究透皮成分对于阐明穴位贴敷疗法的药效物质基础至关重要。

常规的透皮渗透评估方法存在明显的局限性。例如，Franz扩散池结合离体皮肤是评估透皮渗透的经典方法。近年来，仿生膜技术（如脂质基模型、细胞膜包覆纳米系统、双层皮肤等价物等）取得了快速进展，为体外渗透研究提供了更高通量的替代方案。然而，这些体外模型仍难以完全复制活体皮肤的生理复杂性，尤其是穴位区域特有的神经-免疫-血管网络对药物渗透的动态影响[6]。同时，由于中药膏贴成分的复杂性和透皮化合物含量的微量性，透皮成分的非靶向鉴定颇具挑战性。目前常用的技术，如气相色谱-三重四极杆质谱（GC-QqQ-MS），通常用于定量特定的已知化合物，但缺乏准确鉴定复杂中药混合物所需的高分辨能力[7]。

经皮微透析作为一种体内采样技术，提供了一个有前景的替代方案。该技术允许在生理条件下以高时间分辨率和空间分辨率对皮肤中的药物浓度进行连续、实时监测，克服了传统离体方法的许多局限性[8]，[9]。这种精确、微创技术在复杂生物基质研究中日益被认可为关键方法[10]。尽管微透析技术广泛用于研究局部制剂中特定化合物的药代动力学，但鲜有应用于穴位贴敷疗法中复杂透皮成分的非靶向鉴定[11]。这一应用需要与能够区分复杂微透析液中痕量化合物的分析方法联用[12]。LC-Orbitrap-MS和GC-Orbittrap-MS均已作为非靶向鉴定的强有力平台崭露头角，具有高分辨率（m/z 200处高达120,000 FWHM）和高质量精度（<3 ppm），且已被证明在阐明中药治疗的作用机制方面具有重要价值[13]。鉴于大多数能够透过角质层的化合物通常具有分子量低、脂溶性适中、熔点低的特点，微透析与GC-Orbitrap-HRMS的结合为发现穴位贴敷疗法的透皮成分并明确其物质基础提供了一种极具前景的新平台。

姜平贴（JPT）由九种等比例配伍的中药组成（茯苓、石菖蒲、香附、苍术、丁香、苍术、党参、白术和甘草）。该方源自经典名方香砂六君子丸。根据《中国药典》，香砂六君子丸具有补气、健脾、和胃的功效，因此被公认为临床上治疗消化不良的代表方剂[14]，[15]。一项涵盖23项随机对照试验、2101名受试者的系统评价和meta分析证实，香砂六君子汤可显著提高功能性消化不良患者的临床总有效率、胃排空率和症状评分，且未报告明显的不良事件[16]。化学研究表明，许多组成药材，如石菖蒲、香附、苍术、丁香和大苍术，富含挥发性萜类和苯丙烷类化合物。这些化合物通常具有脂溶性和分子量低的特点，有利于被动扩散透过角质层，是透皮递送的理想候选成分[17]。为了提高儿科患者的治疗依从性和合规性，香砂六君子丸已被重新配制成透皮贴剂（JPT），该剂型无创且易于给药。临床上，JPT通常贴敷于患儿的神阙穴。然而，目前尚无研究针对其活性透皮成分或渗透特征进行深入探讨。

尽管透皮行为与化合物的脂溶性有关，但姜平贴的化学复杂性和多种成分之间可能存在的相互作用使得无法简单地预测哪些成分会优先渗透。因此，需要一种准确的分析方法来确定JPT的实际透皮成分。在本研究中，基于我们之前的工作[18]、[19]、[20]，采用GC-Orbitrap-HRMS鉴定了JPT中的成分。此外，将微透析技术与GC-Orbitrap-HRMS联用，用于鉴定透皮成分并分析其透皮特征（图1）。所建立的方法为研究穴位贴敷疗法的透皮特性提供了一种准确的工具。我们认为这是首次利用GC-Orbitrap-HRMS与微透析联用来研究穴位贴敷疗法的透皮特性。

摘要片段

化学试剂与材料

麻醉剂替来他嗪-唑吡坦（Zoletil 50）购自Virbac公司（法国卡罗斯）。(?)-松油醇、(?)-月桂烯酮、乙酸龙脑酯和丁香酚标准品购自阿拉丁公司（中国上海）。丁香醇、萜烯酮、endo-冰片和苍术酮标准品购自博纯公司（中国成都）。C7-C40正构烷烃混合标准溶液（1000 μg/mL）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯），储存于2-8 °C。HPLC级正己烷

色谱参数与提取方法的优化

在筛选了多种不同极性的色谱柱后，最终选择了TG-5SILMS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），因为它对JPT中复杂挥发性成分的整体分离效果最佳。同时，其低极性和高惰性使其特别适合通过GC-Orbitrap-HRMS对复杂基质中痕量化合物进行灵敏检测。此外，为实现JPT中复杂挥发性成分的最佳分离，我们系统地评估了

结论

在本研究中，我们建立了一种结合微透析技术和GC-Orbitrap-HRMS的综合平台，作为从JPT中快速鉴定透皮成分并表征其渗透特征的非靶向筛选方法。利用该方法，共在JPT中鉴定出204种挥发性化合物，其中123种为新报道。值得注意的是，包括乙酸龙脑酯、丁香酚、丁香醇和苍术酮在内的66种化合物被成功筛选为大鼠

作者贡献声明

Haolu Wang：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，软件使用，数据整理。Lixing Nie：数据整理。Yu Wu：数据整理。Lianjia Li：软件使用。Tianyang Zhang：软件使用。Jie Yang：经费获取。Lu Sun：论文撰写——审阅与编辑。Xiaodong Wen：论文撰写——审阅与编辑，经费获取。

基金资助

本工作得到中国药科大学附属江宁中医院（项目编号：YJZD2025008）、国家自然科学基金委员会（项目编号：82374024和82374105）的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的财务利益或个人关系冲突。

致谢

感谢梁孟元和姚慎盟在样本采集和数据分析方面提供的帮助。

Haolu Wang|Lixing Nie|Yu Wu|Lianjia Li|Tianyang Zhang|Jie Yang|Lu Sun|Xiaodong Wen