《Scientific Reports》：Comparative hepatoprotective efficacy of spirulina polysaccharides and crude spirulina against metalaxyl-m toxicity via modulation of oxidative stress and Nrf2/NF-κB gene expression
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肝脏是机体中心代谢枢纽，作为对抗全身性毒素和外源性物质（xenobiotics）的主要前线防御器官。然而，这种持续解毒作用使其独特易受现代农用化学品日益增长的威胁影响。其中，甲霜灵-M（metalaxyl-m）是一种广泛使用的手性农药，随着全球向复杂化学合成转
肝脏是机体中心代谢枢纽，作为对抗全身性毒素和外源性物质（xenobiotics）的主要前线防御器官。然而，这种持续解毒作用使其独特易受现代农用化学品日益增长的威胁影响。其中，甲霜灵-M（metalaxyl-m）是一种广泛使用的手性农药，随着全球向复杂化学合成转变持续增加此类生物活性化合物的流行，其构成显著风险。本研究旨在探讨甲霜灵-M的肝毒性机制，并探索钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）及其生物活性多糖中和该损伤的潜力。研究人员的发现表明，甲霜灵-M暴露通过破坏核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）信号通路触发严重肝毒性，导致抗氧化防御系统（GSH、CAT、SOD）崩溃、显著氧化应激（MDA升高）以及肝酶（ALT、AST）急剧上升。在分子水平上，毒性由炎症和凋亡标志物上调驱动，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Toll样受体4（TLR4）和核因子κB（NF-kB）。相反，给予螺旋藻及其分离多糖有效抵消这些病理变化。值得注意的是，螺旋藻多糖有效维持肝细胞完整性，并显著上调组织沉默信息调节因子1（SIRT1）免疫组化表达。这些发现突显其作为减轻农药诱导肝毒性天然候选物的保护潜力。
研究背景方面，肝脏承担解毒和外源性物质代谢功能，因而易受农用化学品损伤。甲霜灵-M（metalaxyl-m）是一种广泛用于水果、蔬菜和谷类作物保护中的酰基丙氨酸类杀菌剂，因广泛使用已在不同环境基质中检出；其土壤吸附弱、水溶性高，易淋溶进入地下水并通过农业径流污染邻近水体。人类暴露及后续毒性风险不可忽视。已知甲霜灵-M可引起不良肝毒性效应，但其潜在分子机制仍大多不明。已有哺乳动物毒理学研究提示肝脏是甲霜灵-M暴露的主要易感器官，并可见大鼠来源肝细胞和人脐带内皮细胞毒性；甲霜灵-M可诱发氧化失衡，升高丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和核因子κB（NF-κB），降低谷胱甘肽（GSH），并影响丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）及脂质水平。氧化应激下，核因子E2相关因子2（Nrf2）从胞质抑制蛋白Keap1解离并激活抗氧化防御系统，维持细胞氧化还原稳态；杀菌剂可经持续活性氧（ROS）生成促进Keap1介导的Nrf2降解并下调血红素加氧酶-1（HO-1）等抗氧化效应分子。钝顶螺旋藻（Spirulina platensis，SP）为丝状光合蓝细菌，富含蛋白质、维生素、矿物质、必需氨基酸、脂肪酸及类胡萝卜素等抗氧化色素；其抗氧化潜力来自藻蓝蛋白、β-胡萝卜素、γ-亚麻酸、生育酚和含酚分子，C-藻蓝蛋白（C-Pc）具有抗氧化和自由基中和活性，并可抑制肝微粒体脂质过氧化。螺旋藻多糖（SPLP）约占螺旋藻干重10%，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗辐射和降血糖等生物活性，可通过淬灭活性自由基、调节聚合物基团和增强内源性抗氧化防御发挥抗氧化作用。基于此，研究人员旨在研究螺旋藻及其活性成分多糖对甲霜灵-M所致大鼠肝毒性的潜在保护作用，并通过抗氧化防御酶、炎症和凋亡生物标志物进行评估。该研究的意义在于从Nrf2/HO-1、SIRT1及TLR4/NF-κB/TNF-α轴阐明甲霜灵-M肝毒性机制，并比较粗制螺旋藻与螺旋藻多糖的保护效能，为农药诱导肝损伤提供天然候选物。
关键技术方法方面，研究人员自螺旋藻热水浸提、乙醇沉淀制备多糖，并用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）和总碳水化合物分析进行表征；采用36只成年雄性白化Wistar大鼠（Mansoura大学药学院动物房来源），随机分为6组、每组6只，连续28 d每日口服给予玉米油、螺旋藻300 mg/kg b.wt、螺旋藻多糖150 mg/kg b.wt、甲霜灵-M 60 mg/kg b.wt（1/10 LD
50）及螺旋藻或多糖提前1 h联合甲霜灵-M；检测血清ALT、AST，肝匀浆GSH、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、MDA，qRT-PCR检测Nrf2、HO-1、Sirt1、TNF-α、TLR4、NF-κB，并进行H&E组织病理评分及SIRT1免疫组化ImageJ定量。
研究结果方面，（1）多糖提取：100 g螺旋藻获得13.734 g总多糖。（2）螺旋藻多糖的光谱学检查：FT-IR显示典型多糖吸收峰，包括O–H、C–H、C=O、C–H及吡喃环C–O–C伸缩振动，并提示β构型糖苷键；XRD显示高结构有序性和高结晶度，主峰位于2θ≈32.1°，并见31.0°、45.1°及22.2°、24.8°、28.7°、37.3°、39.2°、56.5°、66.5°、75.2°等反射峰；总碳水化合物为8.8±0.02 mg/g。通过FT-IR、XRD和总碳水化合物分析，研究人员得出提取多糖具有典型多糖官能团、β-糖苷键及高度有序半结晶结构的结论。（3）螺旋藻及其多糖对肝功能酶的影响：与对照组及单独给予螺旋藻或多糖组相比，甲霜灵-M暴露显著升高血清ALT和AST活性，提示明显肝损伤；口服螺旋藻可显著抑制甲霜灵-M攻击大鼠的这些酶；螺旋藻多糖较粗制螺旋藻更显著降低血清ALT和AST，使水平最接近对照值。通过血清酶活性检测，研究人员得出多糖对肝功能酶恢复优于粗制的结论。（4）螺旋藻及其多糖对肝脏抗氧化状态的保护作用：甲霜灵-M组GSH水平及SOD、CAT活性较对照显著降低；仅螺旋藻处理使甲霜灵-M染毒大鼠CAT活性显著升高，对GSH或SOD无影响；螺旋藻多糖显著提高GSH、CAT和SOD，且SOD活性甚至超过基线对照；对照组与单独螺旋藻组GSH和SOD无显著差异；多糖在提高肝SOD、CAT和GSH方面显著优于粗制螺旋藻。MDA在甲霜灵-M组显著升高，螺旋藻及多糖均显著降低MDA，多糖降幅大于藻体本身，SPLP组MDA显著低于对照组。Nrf2在甲霜灵-M组显著下调，螺旋藻或多糖处理后显著升高；HO-1在甲霜灵-M组显著下调，螺旋藻或多糖处理后显著升高，且多糖上调HO-1高于粗制螺旋藻，二者均显著高于非处理对照；SIRT1在甲霜灵-M组显著降低，螺旋藻或多糖处理后显著升高，且二者对SIRT1表达无显著差异；粗制螺旋藻对Nrf2 mRNA转录水平的上调显著高于多糖组分。通过肝匀浆生化与qRT-PCR，研究人员得出螺旋藻及多糖可恢复抗氧化防御、激活Nrf2/HO-1和SIRT1，且多糖在GSH/CAT/SOD及HO-1方面更优、粗制在Nrf2方面更高的结论。（5）螺旋藻及其多糖对大鼠肝脏炎症标志物的调节：甲霜灵-M组TNF-α、TLR4和NF-κB水平较对照显著升高；螺旋藻或多糖显著降低TNF-α，但二者对TNF-α和NF-κB mRNA表达无显著差异；粗制螺旋藻对TLR4 mRNA的下调显著强于甲霜灵-M组和多糖组分，而螺旋藻多糖对TLR4 mRNA较甲霜灵-M组无显著变化。通过qRT-PCR，研究人员得出两种处理均可降低TNF-α，但粗制对TLR4下调更明显、多糖对TLR4作用不显著的结论。（6）组织病理学结果：对照和单独螺旋藻组肝实质正常；单独多糖组肝实质外观正常并偶见肝空泡；甲霜灵-M组显示弥漫性肝细胞坏死，伴胞核皱缩、深伊红染和核固缩，轻至中度细胞浸润伴纤维化及严重门静脉充血；螺旋藻联合甲霜灵-M组显示局灶、少量至轻度门管区纤维化并混有少量炎症细胞及偶见坏死肝细胞；多糖联合甲霜灵-M组显示轻度肝细胞空泡化和偶见肝细胞坏死，伴少量炎症细胞和少量成纤维细胞；组织病理评分显示处理组病变明显减轻，尤其多糖联合甲霜灵-M组较甲霜灵-M组显著降低。通过H&E染色及半定量评分，研究人员得出螺旋藻及多糖均可减轻甲霜灵-M肝组织损伤、多糖组恢复更明显的结论。（7）免疫组织病理学结果：对照组显示强胞质免疫阳性肝细胞，单独螺旋藻组也见融合性强胞质免疫阳性肝细胞；单独多糖组肝细胞呈中度胞质免疫反应，窦状隙和库普弗细胞表达更高；甲霜灵-M组肝细胞、胆管上皮及周围门管区浸润炎症细胞呈弱免疫阳性；螺旋藻联合甲霜灵-M组肝细胞见散在强胞质表达，多糖联合甲霜灵-M组见局灶至弥漫强免疫阳性肝细胞；SIRT1定量证实螺旋藻联合甲霜灵-M组显著表达，多糖联合甲霜灵-M组表达更高。通过免疫组化及ImageJ定量，研究人员得出螺旋藻及多糖可恢复肝细胞SIRT1表达、多糖联合组表达更强的结论。
讨论部分总结：作者通过FT-IR和XRD确认提取多糖的结构功能性和结晶排列，认为O–H和C=O活性基团密度及β-糖苷键有助于自由基清除、电子供给和结构稳定性，高有序半结晶基质反映链间氢键紧密堆积并影响溶解性和生物活性。作者讨论甲霜灵-M升高ALT和AST提示肝细胞应激及肝细胞质膜完整性破坏，螺旋藻和多糖降低这些酶，显示较强保肝能力，并与既往关于螺旋藻对抗溴氰菊酯、二嗪农、丙烯酰胺等肝毒性及多糖保护肝损伤的研究相一致。作者认为甲霜灵-M诱导严重氧化应激，表现为MDA升高及GSH、CAT、SOD降低，螺旋藻和多糖通过抑制脂质过氧化和恢复内源性抗氧化防御发挥保护作用，这与螺旋藻在多种毒理模型中降低MDA、恢复GSH/CAT/SOD的报道一致，也与其他微藻多糖和多糖类物质增强肝GSH、CAT、SOD并降低MDA的结果一致。作者指出甲霜灵-M抑制Nrf2和HO-1 mRNA表达，螺旋藻或多糖逆转抑制并上调二者，Nrf2/HO-1轴在维持细胞氧化还原稳态中起基础作用；HO-1作为Nrf2下游重要响应基因，其上调对甲霜灵-M诱导氧化损伤具有保护作用；SOD和HO-1转录水平超过对照可能代表代偿性生物反应或实验离散，而非基线生理增强。作者还讨论甲霜灵-M降低肝SIRT1 mRNA，螺旋藻或多糖恢复SIRT1转录水平；SIRT1作为代谢和转录调节因子负向调节NF-κB介导的炎症级联，其恢复有助于抑制NF-κB驱动炎症和维持细胞代谢稳态。炎症方面，甲霜灵-M增强TLR4、NF-κB和TNF-α转录表达，螺旋藻或多糖减弱促炎反应，多糖对TNFα下调尤其明显；NF-κB是肝脏炎症反应主转录调节因子，TLR4/NF-κB轴激活可诱导炎症级联并加重组织损伤。组织病理学显示螺旋藻或多糖将严重实质坏死转为轻微局灶病变并保留结构微架构，支持其保肝作用。研究结论部分翻译为：总之，螺旋藻和螺旋藻多糖有效减轻甲霜灵-M诱导的肝毒性。这些保护作用通过抑制氧化应激和促炎信号（TLR4/NF-κB/TNF-α），同时恢复转录和免疫组化表达水平的抗氧化防御（Nrf2/HO-1）及SIRT1，从而维持整体肝脏结构完整性。
