Allplex RV Master Assay与BioFire Respiratory Panel 2.1 plus检测呼吸道病毒的多重PCR平台比较评估及诊断一致性分析

《Scientific Reports》：Comparative evaluation of Allplex RV master assay and biofire respiratory panel 2.1 plus for detection of respiratory viruses

呼吸道感染是全球最常见的疾病之一，尤其在儿童、老年人和免疫功能低下人群中造成显著发病率和死亡率。早期、准确的诊断对于降低其健康负担至关重要。诊断方法包括培养、血清学和快速抗原检测；然而，核酸扩增检测，尤其是多重PCR（multiplex PCR），因其高敏感性和特异性而被视为金标准。本研究旨在比较开放PCR多重平台Allplex RV Master Assay检测呼吸道病毒的诊断性能，并以基于卡盒的症候群平台BioFire Respiratory Panel 2.1 plus（RP2.1plus）作为对照。研究人员对65份阳性鼻咽拭子开展横断面研究，并使用两种系统进行分析。阳性符合率（PPA）范围为75%～100%，阴性符合率（NPA）范围为92.59%～100%，kappa（κ）值范围为0.48～1.00。两种检测方法之间良好的一致性支持将Allplex Respiratory Panel 1作为病毒性呼吸道感染快速、准确诊断的可靠替代方案。

研究背景：呼吸道感染在全球范围内高发，儿童、老年人和免疫功能低下人群的发病率和死亡率较高。原文指出，2016年下呼吸道感染导致全球238万人死亡；在埃及，肺炎和急性呼吸道感染所致儿童死亡占全部死亡的10%。呼吸道感染病原包括革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、非典型细菌、呼吸道病毒、真菌和厌氧菌。早期、准确诊断有助于合理抗病毒或抗菌治疗、感染控制和缩短住院时间；病原不明常导致对可能为病毒性感染的病例使用抗生素，既无获益，又可能引起抗菌药物耐药和全身抗菌药物不良反应。传统病毒培养为参考方法，但耗时、昂贵、依赖设备和专业人员；血清学检测通常在免疫应答形成后数周才提供结果。多重实时PCR（RT-PCR）可快速检测多种呼吸道病原；基于卡盒的系统如BioFire可在约1 h内鉴定病毒、细菌及部分耐药基因，而开放PCR平台如Allplex需要手工样本处理、核酸提取和数据分析。因此，研究人员以BioFire RP2.1plus为对照，比较Allplex RV Master Assay检测呼吸道病毒的诊断性能。

关键技术方法：研究人员在Ain Shams University分子微生物实验室开展描述性横断面研究，纳入2023年12月至2024年12月Ain Shams University Hospitals不同科室住院、疑似呼吸道感染且BioFire检出呼吸道病毒阳性的65份鼻咽拭子（NPS）；排除混合病毒/细菌、重复及无目标样本。NPS经VACUTTE管PBS运输，2–8 ℃、2 h内送检，BioFire后?70 ℃保存，每15份提取核酸并行Allplex。两法使用同一原始标本aliquot：BioFire FilmArray RP2.1plus与Allplex RV Master Assay（检测SARS-CoV 2、PIV、Flu B、ADV、Flu A、HRV、MPV、RSV；BIO-RAD CFX96，Seegene viewer；Ct<38为阳性，≥38为阴性）。统计采用PPA、NPA、Cohen's kappa（κ）及不一致率。

研究结果：共检测65份阳性NPS，男29例（44.6%）、女36例（55.4%），年龄1天至41岁。HRV为两法最常检出的病毒；MPV仅由Allplex检出1例（2%），BioFire未检出。两法均检出全部65份样本中的病毒，但Allplex识别出更多共感染。PPA为75%～100%，NPA为92.59%～100%，κ为0.48～1.00。PIV和HRV呈几乎完美一致（κ分别为1.000和0.877）；SARS-CoV 2、ADV、Flu A和RSV呈显著一致（κ分别为0.661、0.765、0.809和0.745）；Flu B呈中等一致（κ=0.488）。多数检出病毒的总体一致率超过90%，但SARS-CoV 2的PPA为75%、HRV的PPA为88.88%。不一致率以SARS-CoV 2最高（7.7%），PIV为0%。BioFire检出4例HRV（6.2%不一致）而Allplex未检出；Allplex额外检出ADV 4例（6.2%）、Flu A 4例（6.2%）、Flu B 2例（3.1%）、RSV 3例（4.6%）和MPV 1例（1.5%），这些样本BioFire均为阴性。Allplex假阳性结果经复核未发现相邻孔污染证据；Allplex假阴性无BioFire Ct值可解释；不一致结果未采用独立确认方法。BioFire约45 min出结果，适合急诊场景；Allplex约需3～4 h，支持高通量批检测。Allplex每测试16美元，BioFire每测试近120美元，差异为7.5倍。

讨论与结论：讨论部分将结果与Gosert et al.、Lade et al.、Concato et al.、Huh et al.、Lee et al.、Chan et al.、Upadhyay et al.等研究比较，认为病毒检出频率及一致性范围与部分文献相符，但研究人群、季节、地区、Allplex panel配置、样本量和样本选择不同，比较需谨慎。不一致可能源于低病毒载量、采样技术或时机、PCR抑制、序列变异影响引物/探针杂交、标本处理、多重靶标竞争、交叉反应、既往感染残留核酸或检测特异性不足；BioFire将Rhinovirus/Enterovirus合并报告，而Allplex单独检测HRV，也可能造成差异。局限包括样本量、病毒覆盖范围较窄、无测序或病毒培养等金标准确认、操作变异、部分靶标阳性数少致置信区间宽，以及未纳入阴性标本评估特异性。

结论翻译：BioFire FilmArray Respiratory Panel与Allplex RV Master Assay之间良好的一致性，为设备停机或试剂短缺时提供了可靠备份选择。BioFire FilmArray具有封闭、用户友好系统的特点，周转快、全自动流程且结果解释标准化；但其每测试成本高于PCR，通量较低，因为每次运行处理一个样本。Allplex具有高通量检测特点，每次运行可测试最多96个测试，可设计为更高通量，或在采用标本批处理时实现快速周转。Allplex还具有广谱多重检测能力，可在单一样本中同时检测多种呼吸道病毒靶标，但缺乏细菌靶标；同时，其更依赖实验室专业能力，核酸提取和PCR处理步骤更多，增加污染风险。成本比较方面，Allplex流程需要单独的核酸提取和PCR准备，每样本成本随批量大小变化；BioFire采用集成卡盒系统，每测试耗材成本固定。建议使用病毒培养或测序等金标准参考方法进行并行检测，以验证结果并识别假阳性和假阴性；制定确保正确采样、储存、运输和处理的方案，并结合定期员工培训和质量保证措施，有助于减少变异并确保结果可重复性。