基于大肠杆菌表达OmpA蛋白的多杀巴氏杆菌抗体间接ELISA检测方法优化与初步评价

《Scientific Reports》：Heterologous expression of the membrane protein OmpA from bovine Pasteurella multocida and establishment of an indirect ELISA for antibody detection

摘要

监测多杀巴氏杆菌（Pasteurella multocida）抗体需要可靠的血清学工具。本研究在大肠杆菌系统中表达了四种多杀巴氏杆菌膜蛋白，并通过Western blotting和间接ELISA进行筛选。其中，经稀释复性处理的OmpA蛋白制备物保留了血清免疫反应性，并满足所测试条件下的抗原选择标准。优化后的检测方法使用1 μg/mL的总蛋白包被浓度、1%脱脂奶粉在37°C下封闭1小时、血清稀释1:400、二抗稀释1:25,000，显色时间为15分钟。在初步的分析特异性检测面板中，可用的PmB阳性血清以及针对其他八种牛呼吸道病原体的阳性血清均低于判定阈值下限。PmA阳性血清在1:1280稀释度时仍为检测阳性，批内和批间变异系数均低于5%。在由免疫接种定义的60份血清开发面板中，ROC分析得出的AUC为0.969，相对于预定义血清组的表观灵敏度和特异性均为95.00%。这些结果为初步估计，因为该检测面板仅来自单一牧场，用于建立判定阈值的同一组20份预定义阴性参考血清也被重复使用，且未采用独立参考方法进行验证。