胡桃楸隔膜提取物的细胞保护作用评价及其用于局部给药的凝胶与膜剂开发

《Pharmaceutics》：Cytoprotective Evaluation of Juglans regia L. Septum Extract and Development of Extract-Based Gels and Films for Topical Application

　　

背景/目的：胡桃楸（Juglans regia L.）隔膜是富含酚类化合物的资源，具有潜在的皮肤相关生物活性。本研究评估了冻干胡桃楸隔膜提取物的细胞保护活性，并开发了适用于局部给药及半固体挤出（SSE）3D打印的含提取物聚合物凝胶。方法：采用高效液相色谱-光电二极管阵列检测法（HPLC-PDA）对提取物进行表征，并在暴露于H2O2的人成纤维细胞中评估其活性。制备了基于聚乙烯醇（PVA）、羧甲基纤维素钠（CMC）和羟乙基纤维素（HEC）的凝胶，并将选定配方通过溶剂浇铸法和SSE 3D打印加工成膜。对膜剂进行了厚度、含水量、力学性能及探针-膜黏附性评估。结果：鞣花酸是定量检测到的主要酚类化合物（36.453 μg/mL）。游离提取物保护成纤维细胞免受H2O2诱导的氧化损伤，在75和100 μg/mL浓度下活细胞保存效果最佳。增加提取物载入量使凝胶中总定量酚类含量从10.95 μg/mL增至27.98 μg/mL。选定配方成功加工为多层膜。3D打印膜在爆破强度和单位宽度断裂力方面数值上低于溶剂浇铸膜，但配对差异无统计学显著性。水合作用增加了探针-膜黏附性，而膜含水量在3个月储存期间下降。结论：这些发现支持将具有细胞保护作用的胡桃楸提取物纳入可打印聚合物凝胶以开发局部用膜剂的可行性。

胡桃楸隔膜提取物的细胞保护作用及其局部给药凝胶与膜剂开发：研究解读

一、研究背景与意义

胡桃楸（Juglans regia L.）隔膜作为酚类化合物的丰富来源，近年来受到广泛关注。其植物化学特征包括可水解鞣质、鞣花酸及其衍生物、没食子酸和黄酮类化合物，具有抗氧化、抗菌和抗炎等生物活性。然而，仅凭化学抗氧化测定结果无法确证这些植物化学物质能否保护暴露于氧化损伤的细胞。成纤维细胞在皮肤修复中通过细胞外基质合成、胶原沉积、组织重塑和创面收缩发挥关键作用，而氧化应激会严重影响其功能。过量的活性氧（ROS）可损害线粒体功能、破坏抗氧化防御机制并干扰细胞外基质维持相关通路。因此，采用H₂O₂暴露的成纤维细胞模型可用于评估富抗氧化提取物在氧化应激条件下维持细胞活力的能力。

植物提取物的治疗潜力不仅取决于其内在活性，还取决于能否成功纳入能够在创面部位维持功能的递送系统。亲水性聚合物体系因其高水亲和性，可贴合创面表面、维持湿度并促进活性成分的局部释放，在创面导向应用中具有重要价值。然而，此类体系的性能取决于理化性质和力学性能的平衡，包括维持适度湿润环境、允许气体交换、贴合应用表面以及在操作和使用中保持足够的力学完整性。半固体挤出（SSE）3D打印可将聚合物凝胶通过逐层沉积直接转化为结构化膜剂，其成功高度依赖于前体配方的性质，包括稠度、均质性、可挤出性和沉积后保持形状的能力。

尽管已有研究分别探讨了植物提取物纳入可打印基质、SSE打印工艺参数及膜剂性能，但将胡桃楸隔膜提取物纳入适用于SSE 3D打印的聚合物凝胶-膜体系并进行系统研究的工作尚属空白。特别是，提取物纳入对前体凝胶性质、可打印性、酚类组成以及所得膜剂理化与力学特性的影响，以及与常规浇铸膜剂的对比，均缺乏系统数据。因此，本研究旨在评估冻干胡桃楸隔膜提取物的生物活性，进而开发含提取物的聚合物膜剂，评估其SSE 3D打印适用性、理化与力学性能、化学组成及稳定性，并与常规浇铸膜剂进行比较。

二、主要技术方法

研究人员从立陶宛希奥利艾采集胡桃楸果实，手工分离隔膜后进行乙醇提取、旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，获得冻干提取物（提取率7.5% w/w）。采用高效液相色谱-光电二极管阵列检测法（HPLC-PDA）对提取物及凝胶中酚类化合物进行定性和定量分析。在体外细胞实验中，采用800 μM H₂O₂处理人BJ-5ta成纤维细胞建立氧化应激模型，以Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）荧光双染法评估细胞活力。在制剂开发中，制备了基于PVA、CMC和HEC的凝胶配方，采用溶剂浇铸法和自建SSE 3D打印机（18G不锈钢针头，0.84 mm内径）制备膜剂，并对凝胶进行黏度和pH测定，对膜剂进行厚度、含水量、质地分析（爆破强度、拉伸断裂力）和探针-膜黏附性评估。

三、研究结果

3.1 胡桃楸提取物中检测到的化合物

HPLC-PDA分析在冻干胡桃楸隔膜提取物中定量检测到六种酚类化合物。鞣花酸浓度最高（36.453 μg/mL），其次为鞣花酸戊糖苷（24.144 μg/mL），两者合计占定量化合物总量的一半以上，表明鞣花酸相关成分是提取物的主要化合物。槲皮苷浓度也较高（25.501 μg/mL），确认了黄酮糖苷的存在。两种pedunculagin/casuarin异构体分别定量为13.891和15.098 μg/mL，表明可水解鞣质对整体植物化学组成的贡献。咖啡酰己糖-脱氧己糖苷浓度最低（4.95 μg/mL），但证实了咖啡酸衍生物的存在。

3.2 胡桃楸提取物对H₂O₂诱导氧化应激下成纤维细胞的保护作用

未经处理的对照组以活细胞为主（约255个），而暴露于800 μM H₂O₂ 24小时后，活细胞数量显著减少，细胞死亡大幅增加。过氧化氢酶处理组活细胞数量达到约170个，显示出明确的保护效果。在提取物处理组中，25 μg/mL仅观察到部分保护作用；50 μg/mL时活细胞数量明显增加；75和100 μg/mL时保护效果最为显著，活细胞数量接近过氧化氢酶处理组水平。100 μg/mL处理组呈现最有利的整体细胞分布，活细胞数量高且坏死样和凋亡样细胞数量相对较低。结果表明胡桃楸提取物对氧化应激诱导的成纤维细胞损伤具有浓度依赖性保护作用。

3.3 凝胶的开发与理化表征

在初始配方筛选中，GI和GII的表观黏度高于G配方，而G配方呈现均质、无可见分散颗粒的特征，因此被选为后续研究配方。加入冻干提取物（0.092%、0.138%和0.184% w/w）未显著改变凝胶稠度，3个月储存后各配方黏度也无显著变化。空白配方的pH约为6.1-6.6，加入提取物后pH降至约5.5-5.6，且随提取物浓度增加略有下降。凝胶中定量检测到四种酚类化合物：鞣花酸戊糖苷、鞣花酸、槲皮苷和咖啡酰己糖-脱氧己糖苷。总定量酚类含量随提取物浓度增加从G1的10.95 μg/mL增至G2的19.17 μg/mL和G3的27.98 μg/mL。鞣花酸在所有凝胶配方中均为主要化合物（7.49-17.01 μg/mL）。pedunculagin/casuarin异构体在凝胶中未能定量，可能与其浓度较低、亲水性聚合物基质中的回收率降低、基质相关分析干扰或加工过程中的转化有关。

3.4 膜剂的3D打印及物理力学表征

3D打印膜剂的含水量普遍低于相应浇铸膜剂，可能与打印过程中的额外热暴露及更薄更均匀的沉积层促进水分蒸发有关。3个月储存后所有配方含水量均下降。膜剂厚度方面，选定配方F浇铸膜约0.14 mm，3D打印对照膜FD约0.12 mm。含提取物膜剂厚度在0.11-0.13 mm范围内，随提取物浓度增加略有增加。3个月后所有膜剂厚度均有所减小。力学性能方面，FI爆破强度最高（36.84 ± 4.52 N），F为14.67 ± 2.45 N。3D打印膜剂爆破强度和单位宽度断裂力数值上低于相应浇铸膜剂，但配对差异（F/FD、F1/F1D、F2/F2D、F3/F3D）均无统计学显著性。含提取物浇铸膜剂的爆破强度随提取物浓度增加从F1的13.78 ± 2.00 N逐渐降至F3的11.34 ± 2.42 N。黏附性方面，水合作用显著增加了所有配方的探针-膜黏附性。水合后3D打印含提取物膜剂的黏附性（3.60-3.80 N）普遍高于相应浇铸膜剂（2.58-2.87 N）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，胡桃楸提取物对成纤维细胞的保护作用可能与其酚类组成相关，鞣花酸、槲皮苷、pedunculagin/casuarin异构体及咖啡酰衍生物均可能参与抗氧化活性，但具体贡献和机制需通过分离化合物或分级提取物研究加以明确。凝胶配方选择需在可打印性和最终膜剂完整性之间取得平衡，G配方代表了这一折中方案。3D打印膜剂力学强度数值较低可能与逐层沉积产生的层间界面和不同干燥历史有关，但并非SSE的固有局限。水合作用增加黏附性与亲水性聚合物基质的水诱导溶胀和表面可变形性增强一致。研究的重要局限性在于细胞保护活性仅针对游离提取物验证，最终凝胶和膜剂配方未在成纤维细胞模型中测试，提取物成分从聚合物基质中的释放也未评估。

结论部分总结：本研究证明了冻干胡桃楸隔膜提取物（含鞣花酸及其衍生物、槲皮苷、咖啡酰衍生物和可水解鞣质相关化合物）在H₂O₂诱导氧化应激的成纤维细胞中具有细胞保护作用，75和100 μg/mL浓度下活成纤维细胞保存效果最佳。提取物成功纳入聚合物凝胶，可通过常规浇铸和SSE 3D打印加工为膜剂。增加提取物浓度使凝胶中定量酚类含量从G1的10.95 μg/mL增至G3的27.98 μg/mL，并引起配方依赖性的理化与力学性能变化。含提取物凝胶的pH（约5.5-5.6）适合局部皮肤应用。SSE 3D打印成功制备了多层膜剂，其厚度与浇铸膜剂相当，爆破强度和拉伸断裂力数值上较低但差异无统计学显著性。水合作用显著增加了所有配方的探针-膜黏附性。3个月储存期间所有膜剂含水量下降。提取物浓度、配方组成和制备方法均影响所开发膜剂的理化与力学性能。未来研究应关注长期稳定性、标志性酚类的释放与渗透以及最终配方的生物活性。