《Foods》：Integrative Computational Food Toxicology Implicates a CXCL1-Associated Fibroblast Inflammatory Remodeling Signature in Deoxynivalenol-Related Intestinal Barrier Dysfunction
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一种普遍存在的单端孢霉烯族真菌毒素，其肠道毒性已被广泛认知，然而与DON相关肠屏障功能障碍相关的分子及细胞重塑模式仍未完全阐明。本研究采用整合计算框架，联合网络毒理学、批量转录组学、加权基因共表达网络
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一种普遍存在的单端孢霉烯族真菌毒素，其肠道毒性已被广泛认知，然而与DON相关肠屏障功能障碍相关的分子及细胞重塑模式仍未完全阐明。本研究采用整合计算框架，联合网络毒理学、批量转录组学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习、免疫浸润分析、分子对接、单细胞转录组学、CellChat及计算机模拟基因扰动等方法。从CTD、GeneCards、OMIM和PharmGKB的可追溯保留肠道疾病及屏障相关基因列表中，共获得1119个不同基因。将该基因集与差异表达基因及疾病相关WGCNA模块中的基因相交集，获得23个由数据库和转录组共同支持的肠道疾病/屏障候选基因，并进一步评估其与DON相关肠屏障功能障碍的潜在关联。机器学习进一步筛选出六个枢纽基因：SLC6A14、TIMP1、CXCL1、S100A11、LCN2和NOS2。单细胞图谱揭示成纤维细胞是重要的疾病相关基质细胞区室，而CellChat分析显示疾病样本中CXCL信号增强。CXCL1在疾病相关成纤维细胞中表达显著，其计算机模拟敲除扰动了与炎性重塑、氧化应激、细胞外基质组织及基质细胞活化相关的基因。成纤维细胞亚聚类进一步鉴定出疾病富集的CXCL相关炎性及应激反应状态。综上，这些发现将CXCL1相关成纤维细胞炎性重塑确定为可能与DON相关肠屏障功能障碍相关的候选基质环境，而非DON特异性机制，并为未来实验验证提供了假说生成基础。
一、研究背景与问题提出
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的主要B型单端孢霉烯族真菌毒素，广泛污染小麦、玉米、大麦等谷物，是食品与饲料安全领域的重要关注对象。欧盟法规（EU）2024/1022及美国食品药品监督管理局（FDA）均设定了谷物及制品中DON的限量或建议水平，但由于其在谷物中的广泛存在及加工过程中的相对稳定性，完全避免污染仍十分困难。胃肠道是DON经口摄入后的主要生物学靶器官之一，DON可破坏上皮紧密连接蛋白（如claudin-1、claudin-3、claudin-4、ZO-1、occludin），增加黏膜通透性，扰乱多细胞稳态。然而，DON相关肠屏障功能障碍的分子网络和细胞类型特异性重塑模式尚未完全阐明，尤其是基质细胞（如成纤维细胞）在其中扮演的角色知之甚少。CXCL1作为主要通过CXCR2发挥作用的中性粒细胞趋化因子，已被涉及肠道炎症反应，但CXCL1相关成纤维细胞炎性重塑是否参与DON相关肠屏障功能障碍仍属未知。因此，本研究旨在通过整合计算框架，识别与DON相关肠屏障功能障碍相关的候选分子特征和细胞类型特异性重塑模式，为后续实验验证提供假说基础。
二、研究内容与主要结论
研究人员建立了整合计算毒理学框架，将数据库来源基因信息、批量转录组学、WGCNA、机器学习、免疫浸润分析、分子对接、单细胞转录组学、CellChat及计算机模拟基因扰动相结合。通过三层次证据交集（差异表达基因、疾病相关WGCNA模块基因、数据库来源肠道疾病/屏障基因集），获得23个候选基因，并经机器学习进一步筛选出六个枢纽基因：SLC6A14、TIMP1、CXCL1、S100A11、LCN2和NOS2。单细胞图谱显示成纤维细胞为重要疾病相关基质区室，CellChat分析揭示疾病样本中CXCL信号增强，CXCL1在疾病相关成纤维细胞中高表达，其计算机模拟敲除扰动了炎性重塑、氧化应激、细胞外基质组织及基质活化相关基因。成纤维细胞亚聚类鉴定出疾病富集的CXCL高表达炎性及应激反应状态。研究结论为：CXCL1相关成纤维细胞炎性重塑是可能与DON相关肠屏障功能障碍相关的候选基质环境，而非DON特异性机制，为未来实验验证提供了假说生成依据。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：网络毒理学（整合CTD、GeneCards、OMIM、PharmGKB四个数据库来源的肠道疾病/屏障基因集）；批量转录组差异表达分析（limma，模型开发队列GSE75214，含194例肠黏膜活检，97例溃疡性结肠炎（UC）、75例克罗恩病（CD）、11例非IBD对照）；加权基因共表达网络分析（WGCNA，软阈值β=13，tan模块为疾病相关模块）；整合机器学习框架（11种算法127种配置，随机森林（RF）为最终模型，外部评估队列为GSE193677和GSE235236）；免疫浸润分析（CIBERSORT，LM22矩阵）；分子对接（DON与枢纽基因编码蛋白）；单细胞转录组学（GSE214695，含18例供体34556个细胞，6例健康对照、6例UC、6例CD）；CellChat细胞间通讯分析；scTenifoldKnk计算机模拟基因敲除分析；成纤维细胞亚聚类分析。
四、研究结果
3.1 数据库来源肠道疾病与屏障基因集特征：CTD、GeneCards、OMIM、PharmGKB四个数据库来源列表共1202条记录，去重后获得1119个不同基因符号，其中524个仅见于CTD，499个仅见于GeneCards，1个仅见于OMIM，13个仅见于PharmGKB，82个见于多个数据库。
3.2 转录组特征分析与候选基因鉴定：在GSE75214队列中，以Benjamini-Hochberg校正p<0.05且|log2FC|>0.585为阈值，鉴定出1557个差异表达基因（946个上调、611个下调）。WGCNA分析显示tan模块与疾病状态呈最强正相关（r=0.50，p=9×10?14）。三向韦恩交集获得23个数据库和转录组共同支持的肠道疾病/屏障候选基因。GO富集分析显示这些基因主要涉及免疫和炎症反应、细胞因子相关信号、白细胞相关过程及细胞外或膜相关功能；KEGG分析进一步富集于炎症和免疫相关通路。
3.3 机器学习枢纽基因优先排序与SHAP解释：94个有效分类器配置中，随机森林（RF）分类器排名第一，在模型开发队列GSE75214中AUC为0.999，在外部评估队列GSE193677和GSE235236中AUC分别为0.681和0.727。基于RF变量重要性排序，保留六个最高排名基因SLC6A14、TIMP1、CXCL1、S100A11、LCN2和NOS2作为最终基因面板，六个基因均在疾病组中上调。SHAP分析用于模型事后解释。
3.4 免疫浸润景观与枢纽基因-免疫细胞关联：CIBERSORT分析显示，与对照组相比，疾病组中CD4记忆静息T细胞、静息NK细胞、M0/M1巨噬细胞、活化树突状细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞比例增加，而记忆B细胞、CD4初始T细胞、调节性T细胞（Tregs）、M2巨噬细胞和嗜酸性粒细胞比例降低。CXCL1和TIMP1与中性粒细胞、活化肥大细胞和活化树突状细胞呈显著正相关，而CXCL1、TIMP1、S100A11和SLC6A14与Tregs和M2巨噬细胞呈负相关。
3.5 DON与枢纽基因编码蛋白的分子对接分析：DON与六个枢纽基因编码蛋白均显示负结合能，其中TIMP1（?7.67 kcal/mol）、SLC6A14（?7.23 kcal/mol）和CXCL1（?7.09 kcal/mol）结合能相对较低，提示与DON具有更有利的预测结构兼容性，主要涉及氢键、范德华力、疏水接触及盐桥/离子相互作用。
3.6 枢纽基因在肠黏膜细胞群体中的单细胞定位：单细胞分析保留34556个细胞，注释为十种主要细胞群体。SLC6A14主要表达于上皮细胞；TIMP1在单核细胞中平均表达最高，其次为成纤维细胞和内皮细胞；CXCL1在中性粒细胞中平均表达最高，但表达百分比最高的为成纤维细胞；S100A11在单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞中广泛表达；LCN2主要富集于上皮细胞和杯状细胞；NOS2表达较稀疏，主要见于上皮细胞。疾病组中浆细胞（37.00% vs. 21.77%）和成纤维细胞（7.74% vs. 5.03%）比例升高，而T细胞、上皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞比例降低。
3.7 CellChat细胞间通讯分析与疾病成纤维细胞中CXCL1扰动：CellChat分析显示疾病组CXCL信号信息流增强，检测到CXCL1–ACKR1和CXCL1–CXCR2配体-受体相互作用。CXCL1在疾病样本成纤维细胞中检出频率最高。scTenifoldKnk虚拟敲除疾病成纤维细胞中的CXCL1，鉴定出179个显著扰动基因，代表性基因包括MIF、CYBA、CXCL14、COL6A2、HSPB1和EMILIN1，涉及炎性重塑、氧化应激、细胞外基质组织和细胞应激。
3.8 成纤维细胞亚聚类揭示疾病相关成纤维细胞状态异质性：成纤维细胞独立再聚类鉴定出五种状态：收缩性成纤维细胞、细胞外基质（ECM）重塑成纤维细胞、低ECM成纤维细胞、CXCL高表达炎性成纤维细胞和应激反应成纤维细胞。疾病样本中CXCL高表达炎性、应激反应和低ECM成纤维细胞比例较高，而对照样本中收缩性和ECM重塑成纤维细胞相对丰富。CXCL1主要检测于CXCL高表达炎性和ECM重塑成纤维细胞中。
五、讨论与结论
讨论部分指出，六个枢纽基因可能代表肠道炎症和屏障相关重塑的不同方面：SLC6A14与上皮转运相关，TIMP1与ECM重塑和基质活化相关，CXCL1与免疫浸润和CXCL介导的细胞间通讯相关，S100A11与黏膜应激反应相关，LCN2与上皮损伤相关反应相关，NOS2与一氧化氮相关炎症信号相关。免疫浸润分析将枢纽基因特征与肠道免疫微环境改变联系起来。分子对接提供了DON与候选蛋白结构兼容性的探索性证据。单细胞图谱明确了枢纽基因的细胞来源。CXCL1在多分析层面收敛为候选因子，其相关成纤维细胞活化并非DON特异性，已在多种炎症条件下报道。成纤维细胞亚聚类支持疾病相关基质异质性的存在。研究局限性包括：基于公共肠道疾病转录组而非直接DON暴露组织数据；GSE75214中组织部位与疾病亚型部分混杂；外部队列AUC下降提示模型可迁移性有限和可能过拟合；CIBERSORT和CellChat为计算推断；分子对接和虚拟基因敲除需实验验证。研究结论为：本研究建立了整合计算框架，优先排序了SLC6A14、TIMP1、CXCL1、S100A11、LCN2和NOS2六个枢纽基因作为探索性分子特征，进一步分析将CXCL1相关成纤维细胞炎性重塑确定为可能与DON相关肠屏障功能障碍相关的候选基质环境，该发现不应被解释为DON特异性反应，而是数据库来源肠屏障证据在DON相关毒理学背景下与肠道微环境既定炎性重塑程序的假说生成性交集，为未来实验验证提供了候选靶点和细胞环境。
