基于Au@CeO2纳米颗粒催化信号增强的侧流免疫层析法高灵敏检测肉类样品中的β-激动剂马布特罗

《Foods》：Sensitive Lateral Flow Immunoassay of Beta-Agonist Mabuterol in Meat Samples Using Au@CeO2 Nanoparticles as a Catalytic Signal-Enhancing Label

　　

摘要：使用β-肾上腺素受体激动剂（β-agonists）来提高农场动物生产力可能导致人类通过受污染食品无意摄入这些物质。为确保有效检测和预防这些即使在低污染物浓度下也会出现的风险，研究人员开发了一种用于检测β-激动剂马布特罗（MAB）的高灵敏度侧流免疫层析法（LFIA）。研究人员比较评估了两种纳米颗粒标记物：传统金纳米颗粒（AuNPs）和双金属核壳结构Au@CeO2纳米颗粒（Au@CeO2 NPs）。研究人员对检测方案进行了系统优化，包括免疫试剂浓度、反应介质组成和检测时间。利用Au@CeO2 NPs的类过氧化物酶活性，将催化放大策略整合到LFIA方案中。这是通过用基于3,3',5,5'-四甲基联苯胺的底物处理测试条来实现的。与传统的基于AuNPs的LFIA相比，Au@CeO2 NPs在一步催化模式下使仪器检测限降低了2.6倍（达到0.6 ng/mL），在两步催化模式下降低了6倍（达到0.26 ng/mL）。总检测时间为18分钟。使用牛肉、猪肉和鸡肉提取物进行的基质效应评估得出检出率范围为80%至139%，表明所开发方法的潜在适用性。此外，所开发的利用Au@CeO2 NPs催化特性的检测模式，为食品安全监测中其他低分子量有毒污染物的高灵敏检测提供了一个有前景的平台。

基于Au@CeO₂纳米颗粒催化信号增强的侧流免疫层析法高灵敏检测肉类样品中的β-激动剂马布特罗：论文解读

1. 研究背景与目的

全球食品生产的扩张依赖于集约化农业方法，这通常伴随着促生长物质（如β-肾上腺素受体激动剂）的使用。β-激动剂（beta-agonists）如马布特罗（MAB）被用于提高饲料转化效率、促进肌肉增长和减少脂肪沉积，但其残留物对人体健康构成显著危害，可影响中枢神经系统并导致心血管疾病。因此，大多数国家严格禁止将其作为生长促进剂使用。为确保食品安全，亟需开发快速、高灵敏的检测方法。虽然色谱技术能够实现复杂混合物中成分的定性与定量，但需要专门设备和专业人员，适用于集中确证分析。而酶联免疫吸附试验（ELISA）虽灵敏度高，但依赖实验室设备，限制了其在现场初筛中的应用。侧流免疫层析法（LFIA）因其操作简便、快速、适合现场检测等优势备受关注，但其灵敏度常受限于传统金纳米颗粒（AuNPs）标记物的性能。为此，本研究旨在开发一种基于双金属核壳结构Au@CeO₂纳米颗粒（Au@CeO₂ NPs）的新型LFIA，利用其固有的类过氧化物酶活性实现催化信号放大，从而显著提升对MAB的检测灵敏度，并评估其在肉类实际样品中的应用潜力。

2. 主要关键技术方法

研究人员采用间接竞争免疫层析法格式，其中包被抗原固定在硝酸纤维素膜的测试线（TL）上，而二抗则固定在控制线（CL）上。游离的MAB与固定的包被抗原竞争结合特异性单克隆抗体（MonoAb），随后通过抗物种抗体（GAMI）与纳米颗粒的偶联物引入信号。为实现信号放大，利用了Au@CeO₂ NPs的类过氧化物酶活性，在免疫反应完成后，向试纸条施加含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）、H₂O₂和硫酸葡聚糖的底物溶液进行催化显色。研究中比较了三种不同的肉类样品前处理方法，最终选择乙腈提取后蒸发复溶的方案。所有测试均使用从当地有机食品零售店购买的经认证无毒的牛肉、猪肉和鸡肉样品进行基质效应评估。

3. 研究结果

3.1 关键免疫试剂的制备与验证

针对MAB的单克隆抗体（MonoAb）通过ELISA表征，检测限（LOD）为0.1 ng/mL，工作范围为0.18–1.05 ng/mL。合成了平均直径为27.34 nm的球形AuNPs，以及通过种子介导生长法制备了平均尺寸为33.1 nm的Au@CeO₂ NPs。透射电镜（TEM）、能量色散X射线光谱（EDX）和电子能量损失谱（EELS）证实了Au@CeO₂ NPs的核壳结构。动力学参数显示该纳米酶的类过氧化物酶活性在酸性pH下最大，其对H₂O₂的表观米氏常数（K_M）为930 ± 70 mM，对TMB的K_M为0.09 ± 0.15 mM。动态光散射（DLS）证实了GAMI成功偶联到纳米颗粒表面。

3.2 基于AuNPs的LFIA开发

研究人员对基于AuNPs的LFIA进行了优化，确定了最佳条件：包被抗原浓度0.5 mg/mL，特异性MonoAb浓度3.1 μg/mL，GAMI-AuNPs偶联物在OD₅₂₀=10.0下使用。在此条件下，仪器检测限（LOD）为1.55 ± 0.16 ng/mL，视觉检测限为10 ng/mL，总检测时间为10分钟。交叉反应性研究表明，该系统与克伦特罗（clenbuterol）有17%的交叉反应，与其他β-激动剂及不同类别的兽药交叉反应低于0.01%。

3.3 基于Au@CeO₂ NPs的LFIA开发

利用Au@CeO₂ NPs的催化特性，研究人员开发了一步法和两步法两种催化放大模式。在一步法中，试纸条与含样品、MonoAb和GAMI-Au@CeO₂ NPs偶联物的混合物孵育10分钟后，施加TMB底物反应3分钟。此模式实现了仪器LOD为0.6 ± 0.07 ng/mL，比传统AuNPs-LFIA降低约2.6倍。在两步法中，试纸条首先与样品和MonoAb孵育5分钟，然后转移至含GAMI-Au@CeO₂ NPs偶联物的缓冲液中再孵育10分钟，随后进行3分钟的催化显色。此模式进一步将仪器LOD降至0.26 ± 0.04 ng/mL，比AuNPs-LFIA降低约6倍，工作范围为0.32–1.39 ng/mL。两种模式的视觉LOD均为10 ng/mL，总检测时间分别为13分钟和18分钟。该测试系统在储存两个月后性能无明显变化。

3.4 加标提取物测试

研究人员将优化的两步催化放大LFIA应用于牛肉、猪肉和鸡肉的实际样品检测。通过对三种样品前处理方法的比较，发现采用乙腈萃取、蒸发复溶的方法（方法3）能最有效地去除基质干扰，获得与标准曲线最接近的结果。在使用该方法处理的肉样提取物中，MAB的检出率在80%至139%之间。计算得出的最低检出含量约为0.2 μg/kg，符合国际食品法典委员会对不同β-激动剂设定的最大残留限量（MRLs）标准。

4. 结论与讨论

本研究成功开发了一种用于特异性检测β-激动剂马布特罗的侧流免疫层析法。通过用具有内在类过氧化物酶催化活性的双金属Au@CeO₂纳米结构替代传统金纳米颗粒，将一步法检测的检测限提高了2.6倍，两步法检测的检测限提高了6倍，实现了0.26 ng/mL的仪器检测限。利用牛肉、猪肉和家禽提取物进行的基质效应评估证实了该方法的实际适用性。所提出的间接竞争模式，利用Au@CeO₂作为催化标记物，展示了在食品安全监测中对低分子量有毒污染物进行超灵敏检测的广泛适用性。这种方法不仅通过纳米酶介导的显色反应放大了信号转导，还为酶标记偶联物提供了一种替代方案，从而扩展了快速监测的分析工具库。