低温碳水化合物酶辅助提取掌状红皮藻蛋白及其水解物与模拟胃肠消化产物的抗氧化与血糖管理潜力研究

《Foods》：Enzyme-Assisted Extraction and Hydrolysis of Dulse (Palmaria palmata) Proteins: Characterisation, Antioxidant Activity and Glucose-Management Potential

　　

本研究探讨了温度及碳水化合物酶辅助提取（enzyme-assisted extraction, EAE）对掌状红皮藻（Palmaria palmata）蛋白回收率的影响，并评估了所选蛋白提取物的酶解产物及模拟胃肠消化产物（simulated gastrointestinal digests, SGIDs）的抗氧化活性与血糖管理潜力。结果表明，在4 °C条件下，采用含木聚糖酶和纤维素酶的酶制剂进行预孵育可获得最高的蛋白及生物质回收率（分别为75.1 ± 2.4%和17.6 ± 0.6%）。蛋白提取物经食品级蛋白酶水解后进一步进行模拟胃肠消化（SGID）。水解产物及SGID样品均表现出抗氧化活性，其中SGID样品通常具有增强的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity, ORAC）及2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除活性。Neutrase?水解产物具有最高的二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV, DPP-IV）抑制活性，而SGID样品间则观察到相近的半抑制浓度（IC50）值。所有水解产物/SGID样品在细胞水平实验中均能促进胰岛素及活性胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）的分泌，并抑制DPP-IV活性。上述发现凸显了掌状红皮藻蛋白提取物（PPPE）消化产物在抗氧化及血糖管理应用方面的潜力，支持其作为多功能食品配料的开发利用前景。

掌状红皮藻蛋白的酶辅助提取、水解及其抗氧化与血糖管理潜力研究解读

一、研究背景与意义

随着欧洲食品工业对藻类生物质利用的日益增长，藻类蛋白浓缩物作为可持续替代蛋白源受到广泛关注。掌状红皮藻（Palmaria palmata），俗称dulse或dillisk，是一种红藻（Rhodophyta），也是欧洲消费最广泛的大型藻类物种之一。该藻主要分布于北纬40至80度的大西洋沿岸，2019年欧洲野生采收量达455吨鲜重，另有少量来自养殖生产。前期中试试验已证明掌状红皮藻可在陆基养殖系统和海上实现成功栽培，为其生物质的可持续生产提供了支持。

掌状红皮藻的蛋白含量按4.7的氮-蛋白转换系数计算，报道值为干重的7%至19%（w/w），高于其他海藻物种，因此被视为具有前景的人类食用替代蛋白源。然而，与其他大型藻类相似，掌状红皮藻蛋白的提取面临挑战，原因在于蛋白质被紧密包裹在皮层细胞内，限制了提取效率及工业应用性。目前已探索的提取策略包括碱提、碳水化合物酶辅助提取（enzyme-assisted extraction, EAE）、深共熔溶剂（deep eutectic solvents, DESs）以及超声、脉冲电场等物理技术。不同方法的蛋白回收率差异显著，其中EAE结合碱提可达70%的回收率，单独碱提为45%至61%，而DESs仅14.4%，微波辅助提取为47.6%，超声辅助提取仅为6.9%至12.2%。然而，许多研究未报告蛋白含量、蛋白提取率及生物质提取率等关键性能指标，这些参数对于比较不同提取策略及其工业可行性至关重要。此外，EAE过程中提取温度的影响似乎受到的关注有限，尚未得到系统评估。

考虑到掌状红皮藻细胞壁主要由β-(1→3)/β-(1→4)-D-木聚糖及少量纤维素和β-(1→4)-D-木聚糖组成，含木聚糖酶和纤维素酶的碳水化合物酶制剂可能特别适用于EAE。然而，蛋白酶介导的EAE虽可提高氮回收率，但会导致蛋白降解，可能改变所得配料的工艺功能性和感官属性。因此，在食品级条件下开发提取工艺，同时兼顾蛋白完整性的保留，对于提取物作为工艺功能性食品配料或用于定向生成具有健康促进作用的特定生物活性肽序列尤为重要。

掌状红皮藻蛋白及其水解产物（PPPHs）在体外、计算机模拟及体内研究中已展现出血糖管理、心脏保护及抗氧化活性，显示出作为针对心血管代谢疾病预防和管理的生物功能性食品配料的巨大潜力。然而，关于碳水化合物酶EAE所得蛋白对蛋白水解和胃肠消化的敏感性，以及所得肽对血糖管理机制和抗氧化活性的影响，目前信息有限。因此，本研究旨在探讨碳水化合物酶处理结合碱提过程中孵育温度对掌状红皮藻蛋白回收率的影响，报告关键提取参数，生成蛋白水解物及其SGID样品，并利用体外实验和细胞模型评估其血糖管理及抗氧化活性。

二、主要关键技术方法

研究人员采用多种关键技术方法开展研究。首先，在蛋白提取方法开发中，设计了三种不同的提取方案，比较了不同孵育温度（4 °C与50 °C）和时长对碳水化合物酶辅助提取效果的影响，并采用BCA蛋白定量法和微量凯氏定氮法测定蛋白含量，计算蛋白回收率和生物质提取率。其次，选用五种市售食品级碳水化合物酶制剂（DEPOL^TM 692L、DEPOL^TM 761P、DEPOL^TM 793L、CELLULASE 13L及EXTRALYVE LA2X）进行酶辅助提取，并验证了各酶制剂在4 °C下的内切纤维素酶和内切木聚糖酶活性。随后，采用食品级蛋白酶（Alcalase^?、Neutrase^?、Flavourzyme^?、菠萝蛋白酶及Promod^TM 439L）对优选的蛋白提取物进行酶解，并按照INFOGEST 2.0共识方案进行体外模拟胃肠消化（SGID）。在生物活性评估方面，采用ORAC和ABTS实验测定抗氧化活性，采用体外DPP-IV抑制实验评估抑制活性，并利用BRIN-BD11胰腺β细胞、STC-1肠道内分泌细胞、Caco-2结肠腺癌细胞及HepG-2肝癌细胞等细胞模型分别评估胰岛素分泌促进、活性GLP-1分泌刺激、DPP-IV抑制及抗氧化保护作用。研究使用的掌状红皮藻生物质分别由爱尔兰Irish Seaweed Consultancy Ltd.（ISC）和Pure Ocean Algae Ltd.提供，前者为野生样品（蛋白含量10.86% w/w），后者为养殖池培养样品（蛋白含量16.13% w/w）。

三、研究结果

3.1 蛋白提取方法开发

研究首先评估了三种提取方案对蛋白回收的影响。方案1在50 °C下进行4小时酶处理，蛋白得率低于此前报道的4 °C过夜提取结果，表明较高温度的短时孵育不利于蛋白回收。方案2结合4 °C过夜孵育与50 °C下4小时酶处理，蛋白回收率仍低于预期。方案3采用4 °C过夜酶处理，蛋白提取率与无酶对照相当，且碳水化合物酶辅助提取可获得更高得率。值得注意的是，在提取过程任何阶段进行50 °C孵育均降低了碳水化合物酶辅助的蛋白提取效率。例如，DEPOL^TM 692L在方案1（50 °C）下仅提取19.37 ± 1.53 mg蛋白/g干重初始生物质，而方案3（4 °C）可达43.08 ± 3.53 mg蛋白/g干重。此外，85 °C酶热灭活处理也导致蛋白得率下降。在方案3中，经热灭活处理的蛋白提取量为22.33 ± 1.99至43.62 ± 3.73 mg蛋白/g干重，而未进行热灭活处理的得率为56.58 ± 7.83至79.50 ± 2.69 mg蛋白/g干重。同方案下，EAE较对照显著提高蛋白得率33%至230%。研究人员认为，热处理导致的蛋白变性和聚集是降低可溶性蛋白比例的主要原因，特别是红藻中丰富的藻胆蛋白（phycobiliproteins）具有热不稳定性。由于碳水化合物酶制剂中未检测到蛋白酶活性，后续提取省略了热灭活步骤。

3.2 EAE对蛋白提取率、蛋白回收率和生物质回收率的影响

采用方案3对五种碳水化合物酶制剂单独或组合使用进行提取性能评估。蛋白含量范围为45.87 ± 0.46%（DEPOL^TM 692L与DEPOL^TM 761P组合）至51.82 ± 0.68%（DEPOL^TM 692L单独使用）。生物质提取率范围为对照处理的9.66 ± 0.58%至DEPOL^TM 761P与CELLULASE 13L组合的17.64 ± 0.57%。蛋白回收率范围为对照处理的44.64 ± 2.66%至DEPOL^TM 761P与CELLULASE 13L组合的75.10 ± 2.44%，较对照提高1.68倍。尽管该组合所得提取物蛋白含量低于对照，但因其蛋白回收率和生物质回收率最高而被选用于后续研究。SDS-PAGE分析显示不同碳水化合物酶所得蛋白条带相似，且未出现低分子量降解条带，证实碳水化合物酶无蛋白水解活性。研究还发现，EAE碱提方法在蛋白富集方面似乎存在上限，最大蛋白含量接近50%至55%，进一步提高蛋白纯度可能需要膜过滤或超滤等纯化技术。值得注意的是，生物质回收率最高仅为17.64%，意味着超过80%的原始生物质在加工中被去除，研究建议采用级联生物精炼概念将残余部分作为其他有价值化合物（如硫酸多糖、纤维、酚类化合物）的潜在原料。

3.3 理化特性表征

水解产物的水解度（degree of hydrolysis, DH）受所用蛋白酶影响显著。Neutrase^?获得最高DH（3.37 ± 0.05%），而菠萝蛋白酶获得最低DH（0.44 ± 0.04%）。SGID后所有样品表现出相近的DH值。研究人员指出，本研究DH值明显低于Ghelichi等人报道的43.8%至70.7%，可能归因于水解条件差异（本研究50 °C、4小时，对比24小时孵育）、酶与底物比例（本研究1%，对比1%至3%）以及游离pH条件等因素。分子量分布分析显示，酶解降低了高分子量组分（>10 kDa和10-5 kDa）的比例，其中Alcalase^?与Promod^TM组合及Neutrase^?水解产物中>10 kDa组分降幅最大。SGID进一步降低了高分子量组分比例，使样品主要由≤5 kDa的肽组成，其中<1 kDa肽为最丰富组分，表明掌状红皮藻蛋白易于消化并大量转化为低分子量肽。

3.4 体外抗氧化及DPP-IV抑制活性

ORAC和ABTS实验结果显示，Neutrase^?水解产物在两种测定中均表现出最高抗氧化活性，ORAC值为461.44 ± 37.20 μmol TE/g冻干粉，ABTS值为246.48 ± 6.72 μmol TE/g冻干粉。总体而言，SGID提高了掌状红皮藻水解产物的抗氧化活性。未水解PPPE的ORAC值（121.02 ± 6.50 μmol TE/g冻干粉）高于此前报道的水提（39 ± 4 μmol TE/g）和水/碱提（81.35 ± 14.44 μmol TE/g干重）结果。SGID样品主要由<5 kDa肽组成，且通常表现出高于相应水解产物的抗氧化活性，提示胃肠消化过程中产生的低分子量肽可能有助于增强抗氧化活性。此外，提取过程中可能共提取的酚类化合物、多糖和色素等非蛋白组分也可能对ORAC活性有所贡献。

DPP-IV抑制活性方面，Neutrase^?水解产物表现出最强抑制活性，IC₅₀值为2.11 ± 0.18 mg/mL。SGID进一步提高了掌状红皮藻水解产物的DPP-IV抑制活性，表明胃肠消化释放了更多具有更强效力的生物活性肽。研究指出，含脯氨酸或丙氨酸于N端倒数第二位、X-Pro基序、N端附近疏水或芳香残基以及较短链长（特别是二肽至六肽）的肽段通常具有较强DPP-IV抑制活性，SGID后增强的抑制活性可能与此类肽的生成有关。

3.5 细胞水平葡萄糖调节评估

在BRIN-BD11细胞胰岛素分泌实验中，水解产物处理的胰岛素分泌量普遍高于相应SGID样品。水解产物的胰岛素分泌范围为Alcalase^?水解产物的7.67 ± 1.04 ng/mg细胞蛋白至菠萝蛋白酶水解产物的8.55 ± 1.70 ng/mg细胞蛋白。尽管胃肠消化降低了多数水解产物的胰岛素促分泌活性，但所有SGID样品刺激胰岛素分泌的程度均高于阴性对照和阳性对照。

在STC-1细胞活性GLP-1分泌实验中，未水解PPPE表现出最低刺激效应（阴性对照的47 ± 12%），而PPPE的SGID样品（阴性对照的117 ± 15%）和Alcalase^? + Flavourzyme^?水解产物的SGID样品（阴性对照的117 ± 8%）显著增加了活性GLP-1分泌。SGID前，Alcalase^? + Promod^TM水解产物（阴性对照的113 ± 9%）和Neutrase^?水解产物（阴性对照的109 ± 10%）刺激活性GLP-1分泌的水平与阳性对照（阴性对照的123 ± 3%）相当，但SGID后此效应降低至阴性对照的85 ± 7%和77 ± 6%。相反，直接SGID增强了PPPE的GLP-1促分泌活性，并维持了Alcalase^?和Alcalase^? + Flavourzyme^?水解产物的活性。

在Caco-2细胞DPP-IV抑制实验中，所有样品均以浓度依赖性方式抑制DPP-IV活性。水解产物中，Neutrase^?水解产物具有最低IC₅₀值（3.12 ± 0.13 mg蛋白/mL），菠萝蛋白酶水解产物最高（4.45 ± 0.18 mg蛋白/mL）。PPPE活性最弱，IC₅₀值为5.26 ± 0.46 mg蛋白当量/mL。SGID提高了所有样品的DPP-IV抑制活性，IC₅₀值范围为菠萝蛋白酶SGID样品的2.38 ± 0.21 mg蛋白当量/mL至Alcalase^? SGID样品的2.61 ± 0.18 mg蛋白当量/mL。

3.6 HepG-2细胞抗氧化活性评估

在ABAP诱导的氧化应激模型中，所有样品均对HepG-2细胞具有保护作用。水解产物中，ROS生成量相对于氧化对照的降低范围为菠萝蛋白酶水解产物的22.33 ± 3.81%至Neutrase^?水解产物的25.93 ± 4.58%。SGID样品表现出相似值，范围为Alcalase^? + Promod^TM SGID的21.39 ± 5.11%至Alcalase^? SGID的28.35 ± 5.87%。水解产物与相应SGID样品之间无显著差异，表明SGID后抗氧化活性得以维持。

四、讨论与结论

本研究表明，在4 °C条件下使用木聚糖酶和纤维素酶组合进行水相碳水化合物酶辅助提取，随后进行碱提和等电点沉淀，可在保持蛋白完整性的同时获得最高的蛋白和生物质回收率。通过超滤和渗滤等进一步纯化步骤可能提高提取物的蛋白含量。使用不同蛋白酶对提取蛋白进行酶解，产生了具有多种与血糖管理相关的生物活性的水解产物，包括胰岛素促分泌活性、刺激活性GLP-1分泌、抑制DPP-IV活性以及针对过氧自由基和ABTS自由基的抗氧化活性。模拟胃肠消化通常保留这些生物活性，在某些情况下甚至增强（如DPP-IV抑制活性），表明生物活性肽在胃肠消化后仍然可用。这些结果凸显了掌状红皮藻衍生蛋白水解产物作为针对血糖管理的功能性食品开发中多功能配料的潜力。然而，仍需进一步研究以鉴定负责观察到的生物活性的肽序列，并通过健康和糖尿病人群的急性和长期人体干预研究确认其在体内的功效和生物利用度。