《International Journal of Molecular Sciences》：Hangeshashinto Induces Apoptosis and Suppresses Colorectal Cancer Growth In Vitro and In Vivo
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半夏泻心汤（Hangeshashinto，HST）是一种标准化的七味汉方制剂，用于管理胃肠道症状及化疗相关黏膜毒性，但其直接抗肿瘤活性尚未得到充分表征。研究人员在DLD-1和SW480结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞以及非恶性成纤维细
半夏泻心汤（Hangeshashinto，HST）是一种标准化的七味汉方制剂，用于管理胃肠道症状及化疗相关黏膜毒性，但其直接抗肿瘤活性尚未得到充分表征。研究人员在DLD-1和SW480结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞以及非恶性成纤维细胞和结肠上皮细胞模型中检测了HST的作用。评估了细胞活力、集落形成、凋亡相关终点、基因表达、对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的应答以及代表性成分的活性。在携带DLD-1异种移植瘤的雌性BALB/c-nu小鼠中评估口服抗肿瘤疗效和耐受性。HST优先降低CRC细胞活力和集落形成，并增加annexin V阳性、caspase-3活性、cleaved caspase-3染色和凋亡性核改变。z-VAD-FMK显示出部分恢复细胞活力的非显著趋势。逆转录–定量聚合酶链反应（reverse transcription–quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）结果为探索性；未评估统计学显著性。HST（0.3 mg/mL）与5-FU共处理较5-FU单药在DLD-1和SW480细胞中均显著降低细胞活力；未评估药理协同作用。口服HST抑制异种移植瘤生长；耐受性评估限于体重和血清生化，洗脱期后高剂量组血清尿酸降低。这些发现为进一步研究标准化HST在CRC中的作用提供了临床前基础。
研究背景与立题：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，约20%患者诊断时即有远处转移，许多患者为局部晚期并需多模式治疗。现有手术、系统化疗、选择性直肠癌放疗、靶向治疗和免疫治疗改善了生存，但胃肠道毒性、骨髓抑制和周围神经病变等不良反应可导致减量或停药，免疫检查点抑制剂还可受原发或获得性耐药限制，因此仍需兼顾疗效与生活质量的补充策略。半夏泻心汤（Hangeshashinto，HST）是《伤寒论》《金匮要略》所载经典汉方，在日本医保体系用于胃炎、口腔炎和腹泻等胃肠道疾病，既往临床研究评估其用于化疗性口腔黏膜炎和伊立替康相关腹泻。然而，HST对CRC的直接抗肿瘤活性及分子机制尚未充分阐明。凋亡（apoptosis）抵抗是癌症进展和治疗失败的标志，天然产物具有调节多条细胞死亡相关通路的潜力；氟嘧啶类（fluoropyrimidines）是CRC系统治疗基石，明确HST是否影响5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）细胞应答具有临床相关性；多组分草药可能优先作用于恶性细胞而减少正常组织毒性。基于此，研究人员假设HST可抑制CRC生长且凋亡参与其作用，并在体外和体内开展研究，为HST作为CRC补充治疗候选提供临床前依据。
关键技术方法：采用DLD-1、SW480结直肠癌细胞及HRecF（人直肠成纤维细胞）、Fibro（成人真皮成纤维细胞）、CCD841CoN（非恶性人结肠上皮细胞系）非恶性细胞模型；以CCK-8（Cell Counting Kit-8）测活力、集落形成实验评估克隆生存，以annexin V/PI（膜联蛋白V/碘化丙啶）流式、caspase-3（半胱天冬酶-3）活性、裂解型caspase-3（cleaved caspase-3）免疫荧光及Hoechst染色评估凋亡，以z-VAD-FMK（泛caspase抑制剂）检测caspase依赖，以RT-qPCR（逆转录–定量聚合酶链反应）检测BCL2、BAX、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TP53、BBC3（GAPDH内参）。体内用雌性BALB/c-nu小鼠DLD-1皮下异种移植，口服HST 250或1000 mg/kg/day 14天及7天洗脱，评估瘤体积、体重、血清生化、H&E（苏木精–伊红）及cleaved caspase-3。来源：DLD-1、SW-480/CMV-Luc来自JCRB Cell Bank；HRecF来自ScienCell；Fibro由Cell Applications制造、Toyobo供应；CCD841CoN来自ATCC；HST（Lot 2210014010）来自Tsumura & Co.；小鼠来自The Jackson Laboratory Japan, Inc.。
研究结果：2.1 化学指纹图谱：制造商提供的三维紫外–高效液相色谱（3D-HPLC）及定量数据显示，Scutellariae Radix中baicalin、wogonin较突出，baicalein为痕量；Glycyrrhizae Radix中glycyrrhizin丰富，liquiritin为痕量；Coptidis Rhizoma中检测到berberine，palmatine为痕量；processed ginger中鉴定6-gingerol；Pinelliae Tuber贡献痕量magnoflorine（痕量<0.3 mg/g），定量采用JP18参考标准外标法，结果与JP18规格一致。2.2 细胞活力实验：CCK-8显示HST浓度依赖降低DLD-1和SW480活力，1.0 mg/mL时降低最明显；HRecF、Fibro和CCD841CoN在测试范围内变化很小，无明确细胞毒性证据，提示HST优先降低CRC细胞活力。2.3 集落形成：对照细胞形成大量大集落，HST剂量依赖减少集落数并使集落变小；ImageJ分析显示DLD-1在0.3和1.0 mg/mL显著减少，SW480在所有测试浓度显著减少，表明HST降低CRC细胞长期增殖和克隆生存能力。2.4 凋亡诱导（annexin V/PI、caspase-3活性、免疫荧光和核形态）：2.4.1 Annexin V/PI流式：48 h处理显示总凋亡比例浓度依赖增加，1.0 mg/mL时两株均较对照显著增加。2.4.2 Caspase-3活性：24 h处理显示浓度依赖升高，DLD-1在≥0.3 mg/mL显著，SW480在≥0.1 mg/mL显著。2.4.3 Cleaved caspase-3免疫荧光：48 h处理显示红色阳性细胞剂量依赖增加，1.0 mg/mL时许多细胞呈强红色荧光并伴核浓缩。2.4.4 核形态染色：Hoechst显示0.3 mg/mL时染色质凝集和荧光增强，1.0 mg/mL时明显核浓缩和碎裂，符合凋亡形态。2.5 z-VAD-FMK作用：z-VAD-FMK单独0–100 μM 48 h不影响两株活力；10 μM预处理后HST 0.1或0.3 mg/mL有部分恢复活力趋势，但同一HST浓度下与单用HST比较均未达显著，提示可能存在caspase依赖过程但未确立caspase依赖，其他机制也可能参与。2.6 RT-qPCR分析：HST 0–0.3 mg/mL处理48 h后，两株BCL2均值降低，BAX和TNFRSF10B随浓度和细胞系变化，TNFRSF10A仅轻微变化，BBC3在SW480低浓度较高、最高浓度较低而DLD-1基本不变，TP53无一致浓度依赖模式；结果为探索性描述，未评估统计学显著性，不能确立特定凋亡通路激活。2.7 HST与5-FU联合：30 μM 5-FU降低两株活力并作为比较基线；HST 0.3 mg/mL联合较5-FU单药在DLD-1和SW480中均显著降低细胞活力（Tukey校正p=0.0144和0.0034），未评估药理协同。2.8 体内抗肿瘤疗效：口服HST 250或1000 mg/kg/day 14天及7天洗脱，高剂量组瘤体积增长较对照慢，瘤体积和相对瘤体积的组×时间交互显著（Greenhouse–Geisser校正p=0.0154和0.0490）；探索性时点分析显示高剂量组第21天瘤体积显著低于对照，相对瘤体积在第4、7、11、14、17和21天显著低于对照；H&E显示HST处理肿瘤细胞密度降低并见坏死区域，高剂量组瘤面积比显著降低（Dunnett校正p=0.0017）；cleaved caspase-3阳性面积有增加趋势但未达显著。2.9 体内耐受性：体重变化组间无显著差异，但基线体重组间有差异；AST、ALT、BUN和CRE组间无显著差异；1000 mg/kg/day组尿酸（UA）显著低于对照（Dunnett校正p=0.0274）；耐受性评估限于体重和所测血清生化。2.10 代表性成分：baicalein和wogonin在12.5–100 μM均显著降低两株活力；baicalin在DLD-1≥25 μM、SW480≥50 μM显著；berberine仅在SW480 12.5–100 μM显著，DLD-1无显著降低；isoliquiritigenin仅DLD-1 100 μM明显降低而SW480无；6-gingerol、ginsenoside Rg1/Rb1、liquiritin和glycyrrhizic acid在两株均无显著作用；Fibro中wogonin显著降低活力，isoliquiritigenin数值降低但无统计学意义，其他成分作用很小或无。
讨论部分总结：研究显示HST剂量依赖抑制DLD-1和SW480，对HRecF、Fibro和CCD841CoN作用较小，提示在实验条件下优先影响CRC细胞，但因两个非恶性模型为成纤维细胞、仅一个为结肠上皮细胞系，未确立肿瘤选择性细胞毒性；体外最高1.0 mg/mL为探索性暴露，并不近似临床可达血浆浓度，需进一步PK/PD（药代动力学/药效动力学）和剂量转化研究。多种凋亡相关终点提示凋亡参与，但z-VAD-FMK未显著恢复活力，caspase依赖未确认；RT-qPCR为探索性，未确立蛋白变化或通路激活，DLD-1和SW480有TP53突变报道，p53非依赖PUMA调控及p73背景未在本研究探讨，上游凋亡通路和AIF（凋亡诱导因子）相关caspase非依赖死亡未检测，因此图示总结的是观察效应而非确认的分子机制。成分筛选与既往Dou et al.和Kim et al.报道背景一致，但不证明全HST经同一机制发挥作用；6-gingerol既往在更高浓度和更长暴露下有效，而本研究≤100 μM、48 h无效，差异可能来自浓度、时间和细胞模型；berberine呈细胞系依赖。HST 1.0 mg/mL约提供37.6 μM baicalin、6.7 μM wogonin、2.7 μM berberine、1.7 μM 6-gingerol和<1.1 μM baicalein，而单体验12.5–100 μM，尤其baicalein和wogonin的筛选浓度高于提取物供给，不能确立其为主要活性成分，成分相互作用及口服暴露未评估。Scutellaria baicalensis和baicalin与5-FU联合的既往增强作用涉及CDK–RB（细胞周期蛋白依赖性激酶–视网膜母细胞瘤蛋白）通路，但不能直接外推至HST；本研究仅评估一个5-FU浓度和两个HST浓度，未做正式协同建模，只描述共处理效应而不确立协同或化疗增敏。口服HST抑制DLD-1异种移植瘤，洗脱后仍可检测到抑制，但不确立停药后的持久应答；cleaved caspase-3趋势不确立抑瘤机制；耐受性限于体重和血清生化，主要器官组织病理未充分评估，血清在洗脱后检测可能遗漏治疗期间瞬态异常，不确立总体安全。局限包括单一异种移植模型、每组6只且无先验样本量计算，最终分组经重复随机分配后依据研究者判断基线平衡选择，组织学评估未盲，存在选择偏倚和观察偏倚风险。未来应优先开展暴露相关测试、类器官或患者来源模型验证、更广的凋亡和非凋亡反应评估及HST/5-FU相互作用系统分析；整体支持进一步临床前评估HST作为CRC补充治疗候选。研究结论翻译：HST在CRC细胞中发挥凋亡相关抗肿瘤效应并在体内抑制肿瘤生长。HST 0.3 mg/mL与5-FU单药相比在DLD-1和SW480细胞中均显著降低细胞活力。这些发现支持进一步临床前评估HST作为CRC潜在补充治疗策略。
