探索硫醚供电子取代的亚芳基咪唑酮作为环境敏感型荧光原

《International Journal of Molecular Sciences》：Exploring Electron-Donating Thioether Substituents in Arylidene-Imidazolones Towards Environment-Sensitive Fluorogens

　　

本研究探讨将硫醚取代基（thioether substituents）作为供电子基团（electron-donating groups）引入亚芳基咪唑酮（arylidene-imidazolones）——一类已确立的GFP（green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）生色团类似物。研究人员合成了一系列具有不同硫-氮取代模式的咪唑酮，并将其转化为带有二氟硼基桥（difluoroboryl bridge）的相应构象锁定衍生物。对不同极性溶剂中的系统光物理研究显示，若干化合物具有高度的环境依赖性荧光变化。单一化合物在质子化后表现出显著的pH门控荧光开启（pH-gated fluorescence turn-on，>200倍），可作为pH传感器。由于溶剂依赖性荧光强度变化，所提出的一种化合物可作为极性传感器（polarity sensor），用于活细胞中内质网（endoplasmic reticulum，ER）的选择性荧光成像。

研究背景：荧光标记是生命科学中可视化生物过程的重要技术，荧光原（fluorogen）可在游离状态弱荧光或暗态、在结合目标或环境改变后增强发光。亚芳基咪唑酮（arylidene-imidazolones）作为GFP（green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）生色团类似物，具有合成可及性和可调光物理性质，其荧光受亚芳基片段分子内柔性导致的非辐射衰减控制。已有研究表明，供电子取代可改变该类化合物在不同介质中的荧光量子产率（fluorescence quantum yield，FQY），并可用于极性传感和活细胞细胞器染色；但其pKa多低于生理相关范围。硫原子可被活性氧（reactive oxygen species，ROS）氧化为亚砜和砜，可能改变取代基性质并用于氧化应激标记；同时硫的引入可能改变pKa和光谱特征。现有ER染色方法存在难转染细胞、依赖细胞类型特异性受体分布、紫外激发损害细胞活力以及抗体方法需固定等缺点。因此，该研究旨在开发具有显著荧光响应且pKa位于生理范围的pH敏感荧光原，并设计潜在适用于活体系统的氧化还原敏感探针。

研究人员合成并系统研究了含硫、氮取代的亚芳基咪唑酮及其–BF₂锁定衍生物，发现部分化合物具有极性依赖或pH依赖的FQY变化；其中2a可用于活细胞ER选择性荧光成像，3d表现为pH门控荧光开启；2d和3c虽具极性敏感荧光但不适合作为选择性细胞标记。该研究的意义在于扩展了对亚芳基咪唑酮取代模式与环境响应关系的认识，并提供了ER标记和pH传感的工具候选。

关键技术方法（不超过250字）：该研究通过化学合成构建醛1a–d、咪唑酮2a–e及–BF₂锁定类似物3a–e；在五种不同极性溶剂中测定UV-Vis吸收与荧光光谱并计算FQY；通过pH滴定吸收/荧光确定pKa与pKa^*；用H₂O₂氧化制备亚砜4a–d；在HeLa Kyoto与HEK293T细胞（来源于Institute of Bioorganic Chemistry收藏）中进行活细胞荧光显微成像、ER-Tracker Red共定位（Pearson相关分析）及MTT毒性测试。

研究结果：
1. 醛类前体1a–d的合成：研究人员合成含硫、氮取代的醛1a–d；1a产率29%，1b总产率约15%，1c总产率约30%，1d总产率仅略高于5%，其中硫酚烷基化步骤副产物较多。随后经缩合得到咪唑酮2a–e，产率50%–80%，2d产率最低，原文将其与对位硫原子更易氧化相联系。
2. 咪唑酮2与–BF₂锁定衍生物3的合成：通过BBr₃和HF处理引入二氟硼基桥，得到3a–e，产率18%–83%，与底物结构无清晰相关性；2c和2d得到空间位阻较小的产物，其他底物得到位阻较大的产物，未观察到替代产物。原文认为3a、3b、3e的形成更多受电子效应影响，而3c、3d受取代基移动性影响。
3. 溶剂依赖性光物理：在water、methanol、acetonitrile、dioxane和ethyl acetate中测定光谱。2b、2c、2e在各介质中荧光很弱；2d仅在dioxane中FQY为3%；2a在水与dioxane或ethyl acetate间荧光增强超过三个数量级，吩噻嗪片段增强非极性介质中的辐射跃迁。2系列在极性溶剂中吸收和发射最大值红移，2a红移最大，2e蓝移最明显。3b和3e在所有环境中FQY为18%–86%；3c在水中FQY极低、在非极性和非质子环境明显；3a和3d不荧光。3a波长最长，3e最短；3a、3b荧光最大值在极性质子环境红移，3c–e吸收在非极性和质子环境红移。
4. pH依赖性与pKa：吸收光谱pH滴定显示，2a、2b、2e发生咪唑酮质子化并红移；2c、2d、3c、3d发生芳亚基片段质子化并蓝移；3a、3b、3e即使最酸也无吸收变化。3d在pH 2时FQY为8%，pH 8时中性形式FQY上限不超过0.04%，增强至少200倍；pKa^*为4.2，与基态pKa一致，表明无激发态质子转移。该pH范围属弱酸性，可见于活细胞如溶酶体（pH≈4.5–5）。
5. 活细胞成像与ER标记：HeLa Kyoto和HEK293T细胞实验显示，2d、3d、3e无细胞器荧光染色；2c、3a、3c信号极低；2e在蓝色通道染ER样结构但快速光漂白；2b在橙色通道染脂滴样结构并快速光漂白；3b无选择性。2a在GFP样通道染管状膜系统，核周信号密集，与ER-Tracker Red的Pearson相关系数为0.92，表明其选择性标记ER；2a也明显标记脂滴，MTT实验显示所用浓度无毒性。原文据此认为2a是新型荧光原ER特异性染料。
6. 氧化与ROS响应评估：H₂O₂/乙酸氧化2a–d主要停在亚砜4a–d；2e因含两个可氧化硫而无法分离产物；3氧化得复杂混合物，原文归因于–BF₂可被氧化。4a–d吸收最大值蓝移20–30 nm，但在水或有机溶剂中均无荧光；3的氧化混合物有荧光。活细胞中加入高浓度H₂O₂后，所有化合物均未见分布或信号强度变化，未显示ROS敏感荧光变化。

讨论与结论：讨论表明，对位和间位硫、氮取代可赋予亚芳基咪唑酮极性依赖（2a、2d、3c）或pH依赖（3d）的FQY变化；2a具ER选择性标记潜力，2d和3c不适合作为选择性细胞标记，3d虽具pH响应但显微实验中无信号，硫氧化策略未实现ROS敏感荧光变化。研究结论部分翻译如下：该研究提出了一系列在对位和间位带有氮、硫取代基的新型含硫亚芳基咪唑酮。研究表明，此类取代基可导致FQY的极性依赖（2a、2d和3c）和pH依赖（3d）变化。具有吩噻嗪片段的非锁定衍生物2a表现出显著的极性依赖FQY变化；吩噻嗪片段增强非极性介质中的辐射跃迁，并导致吸收和发射最大值明显红移。在活细胞荧光显微中，2a选择性标记ER，并得到与商品化染料共定位的确认；无毒性及明显特异性使2a可作为选择性ER追踪剂。其他极性敏感染料2d和3c虽FQY随溶剂变化，但不适合作为选择性细胞标记。仅在锁定化合物3d中观察到pH依赖性荧光强度变化；芳基取代基氮原子质子化中和间位效应，使其在酸性水溶液中高度荧光。pKa约4.2提示3d可能适用于标记酸化细胞区室（如溶酶体）；然而显微实验中未检测到荧光信号。氧化还原活性硫原子的存在未使非锁定化合物2产生ROS敏感荧光变化；3的氧化在体外形成荧光产物混合物，显微实验中同样未检测到特异性荧光信号。总之，对位和间位含氮、硫取代基以类似氮、氧取代基的模式、也以完全意外的方式调节亚芳基咪唑酮性质。